Studium populací Ditylenchus dipsaci na území České republiky pomocí metod molekulární biologie

Study of population of Ditylenchus dipsaci from identify the Czech republic by molecular methods

Studium populací Ditylenchus dipsaci na území České republiky pomocí metod molekulární biologie

Miloslav ZOUHAR, Martin MAREK, Joao SARAIVA, Pavel RYŠÁNEK

KOR AF ČZU

Souhrn, klíčová slova

Ditylenchus dipsaci je významným fytoparaazitickým háďátkem střední Evropy. Cílem této práce bylo získat vzorky populací tohoto háďátka z území ČR a použít metody molekulární biologie k jejich diferenciaci. Byly použity metody PCR, RFLP a SSCP. Byly rovněž optimalizovány metody extrakce DNA z rostlinného materiálu a kontaminované půdy.

Ditylenchus dipsaci, diagnostika, biorasa, rDNA, PCR, RFLP, SSCP.

Summary, keywords

Ditylenchus dipsaci is one of the most harmful parasitic nematodes in Central Europe. The aim of the study was to collect samples of D. dipsaci from the Czech Republic and to identify them by molecular methods. Were used methodes PCR, RFLP and SSCP. At the same time methods for DNA extraction from plant material and contaminated soil were optimalized.

Ditylenchus dipsaci, diagnostics, biorace, rDNA, PCR, RFLP, SSCP.

Introduction - Úvod

Ditylenchus dipsaci je volně žijící osní fytoparazitické háďátko. V ČR je řazeno mezi karanténní škodlivé organizmy. Jeho výskyt byl potvrzen na pěstovaných plodinách, především na cibuli, česneku, vojtěšce, na bobovitých rostlinách, bramborách a dalších plodinách i plevelech. Ditylenchus dipsaci je jedním z nejničivějších rostlinných parazitických háďátek zvláště v oblastech mírného pásma. Při absenci ochrany může způsobit úplné zničení hostitelských rostlin. Klíčovým prvkem v ochraně rostlin proti D. dipsaci je jeho včasná a přesná diagnostika (BRZESKI, 1998). Pro diagnostiku lze použít morfologické znaky, ovšem tyto neřeší rozlišení bioras. Použití DNA pro diagnostiku druhů rodu Ditylenchus bylo publikováno (WENDT et al., 1993).

Methods - Metody

Pro izolaci DNA bylo optimalizováno několik metod. Jako základní bylo nutné optimalizovat metodu extrakce z jednoho háďátka, tak aby bylo možné posuzovat případné diference i v rámci jedné populace. Vyšli jsme z metody izolace DNA publikované LI et al. (1988) původně určené pro izolaci DNA ze spermií. Rovněž byla optimalizována metoda extrakce DNA z rostlinného materiálu a půdy.

Pro diagnostiku bylo použito cistronu rDNA. Bylo nutné amplifikovat část cistronu rDNA mezi geny 18S a 26S. Byly použity specifické primery publikované (Fallas 1996) pro amplifikaci rDNA Caenorhabditis elegans a použité pro rozlišení D. dipsaci, D. destructor a D. myceliophagus v práci (WENDT 1993). Pomocí těchto primerů, 18S 5´-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3´ a 26S 3´-GGA ATC ATT GCC GCT CAC TTT-5,´ lze amplifikovat 900 bp dlouhý úsek charakteristický pro D. dipsaci.

Pro restrikční štěpení bylo použito 16 RE (Eco RI, Hinc II, Alu I, Taq I, Bam HI, Eco 321, Bsu RI, Hinf I, Eco 881, Hind III, Dra I, Msp I, Rsa I, Hin GI, Xho I, Bse GI).

Metoda analýzy SSCP je jednoduchou, velice senzitivní a efektivní technikou k detekci mutací typu záměny jedné báze, tedy mutace neměnící délku řetězce NA. (ORITA et al., 1989).

Results - discussion - Výsledky - diskuse

Podařilo se optimalizovat metodu extrakce NA z jednoho jedince. Rovněž lze použít metodu pro izolaci DNA z půdy pomocí kitu firmy Q-biogene. Citlivost metody se pohybuje mezi 100 - 200 háďátky na 500 mg zeminy.

Získané populace zastupovaly biorasy z česneku (7), vojtěšky (2), cibule (1) a čekanky (1). Populace biorasy z česneku získané z různých lokalit vykazují homogenní zastoupení restrikčních míst a ani pomocí SSCP nebyly nalezeny žádné diference. Populace získaná z čekanky vykazuje obdobnou strukturu rDNA jako populace z česneku a nelze ji tedy tímto způsobem odlišit. Naproti tomu populace získané z vojtěšky vykazovaly oproti výše uváděným populacím značné diference. Jak použitím RE (Eco RI, Hinc II, Alu I, Taq I, Eco 321, Bsu RI, Hinf I, Eco 881, Msp I, Rsa I, Hin GI, Xho I), tak při testování pomocí SSCP, či RE SSCP. Stejné diference se vyskytly i u vzorku populace získaného z cibule.

References - Použitá literatura

Brzeski, M. W. (1998). Nemathodes of Tylenchina in Poland and temperate Europe. Muzeum i Institut Zoologii Polska Akademia Nauk Warsawa, 395 p.

Fallas, G. A., Hahn, M. L., Fargette, M., Burrows, P. R., Sarah, J. L. (1996). Molecular and biochemical diversity among isolates of Radopholus spp. from different areas of the world. (1996). Journal of Nematology 28(4): 422-430.

Li, H., Gyllensten, U. B., Cui, X., Saiki, R. K., Erlich, H. A., Arnheim, N. (1988). Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells. Nature 355: 414-417.

Wendt, K. R., Vrain, T. C., Webster, J. M. (1993). Separation of three species of Ditylenchus and some host races of D. dipsaci by restriction fragment length polymorphism. Journal of Nematology 25: 555-563.

Řešeno v rámci grantu QE 1108 priorita III-C-01