Využití CAPS markerů pro studium rezistence rajčete vůči háďátkům rodu Meloidogyne

Využití CAPS markerů pro studium rezistence rajčete vůči háďátkům rodu Meloidogyne

Using CAPS markers for study of tomato resistance against Meloidogyne root-knot nematodes

Sylva Skupinová, Pavel Vejl, Petr Sedlák, Martina Bardová, Jana Ischiová, Marta Andrlová

Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract

CAPS method (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) is one of the methods, which is used for plant genomes analysis. This method was used for tomato (Lycopersicon esculentum) genome analysis with the goal to detect resistance or susceptibility of tomato against Meloidogyne root-knot nematodes. There were tested two methodologies. The first one allows positively detect allelic sequences of Mi gene. By the second one we can detect Mi gene but we cannot obtain restriction fragment. This methodology is not applicable for Mi gene sequencing.

CAPS markers, Meloidogyne incognita, PCR, Mi gene, resistance, tomato, Lycopersicon esculentum

Souhrn

Metoda CAPS - délkový polymorfismus restrikčně štěpené amplifikované DNA (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) je jednou z mnoha metod používaných pro analýzy rostlinného genomu. Metoda byla použita pro analýzu genomu rajčete (Lycopersicon esculentum) s cílem zjištění rezistence nebo senzitivity rostlin rajčat vůči háďátkům rodu Meloidogyne. Byly testovány dvě metodiky. První metodika umožňuje bezproblémově určit alelickou sérii genu Mi, druhá metodika Mi gen pouze detekuje, ale nedochází k restrikčnímu štěpení, tudíž nelze alelickou sérii genu Mi určit.

Úvod

Metoda CAPS délkový polymorfismus restrikčně štěpené amplifikované DNA (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) je kombinací metody PCR (polymerázová řetězová reakce Polymerase Chain Reaction) a RLFP (délový polymorfizmus restrikčních fragmentů Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Detailní popis výše uvedených metod uvádí například Vejl (2000). Metoda CAPS umožňuje velmi rychlou a jednoznačnou detekci genu Mi vgenomu testovaných jedinců a zároveň lze určit rovněž alelickou sérii tohoto genu. Je známo, že dominantní sestava genu Mi určuje rezistenci rostliny vůči napadení háďátky rodu Meloidogyne (Vos et al. (1998), zejména háďátkem Meloidogyne incognita (obrázek 1). Rovněž je známa skutečnost, že dominantní majorgen Mi je v těsné genové vazbě na gen Meu, který řídí odolnost vůči napadení mšicí Macrosiphum euphorbiae uvedené naobrázku 2. Tuto těsnou genovou vazbu studovali a potvrdili Kaloshian et al. (1995),Vos et al. (1998) a Fazal et al. (1994).

Obrázek 1: Meloidogyne incognita Obrázek 2: Macrosiphum euphorbiae

Metodika

Byly použity dvě metody pro určení přítomnosti genu Mi v genomu rostlin vybraných odrůd, linií a štěpící F2 generace odrůdy Nema. Testy detekce genu Mi a jeho alelické série některých odrůd a linií popisuje Skupinová (2002), testy štěpící generace popisuje Skupinová (2001), kdy byla ověřena metodika detekce genu Mi dle Williamson et al. (1994). Tento autor ve svých experimentech používá pro štěpení získaného PCR fragmentu restrikční enzym TaqI. Dle Skupinové (2001) je tato metoda velmi dobře reprodukovatelná a s jejím využitím byla jednoznačně určena rezistence respektive senzitivita testovaných genotypů. U testovaných genotypů byla rovněž bezproblémově a jednoznačně určena alelická série genu Mi jednotlivých sledovaných rostlin. V roce 2002 byla ověřena další metoda analýzy genomu odrůd a F2 štěpící generace rezistentní odrůdy Nema, která je nositelem heterozygotní sestavy genu Mi. Byly testovány odrůdy Domino F1, Nema F1, Petopride F1, Rio Grande F1, Tornádo F1; linie šlechtitelské firmy Moravoseed spol. sr. o. 132, 144, 282 a 19 rostlin štěpící generace odrůdy NemaF1.

Metodu publikoval Yaghoobi et al. (1995). Tato metodika je opět založena na metodě CAPS. Pro amplifikaci 620bp PCR produktu využil Yaghoobi et al. (1995) modifikované metodiky dle Williamson et al. (1994). Zásadní je ovšem použití specifických primerů. Byly použity primery NR 14A/R 5` GTGGCAGGTATCTCATGGAA 3`, NR 14A/U5` GGGAACCTCCATATACAAG 3`. Pro digesci byl použit enzym AccI. Obrázek 3 udává předpokládané schéma elektroforeogramu po restrikčním štěpení enzymem AccI a následné určení alelické série (Yaghoobi et al.,1995).

Obrázek 3: Schéma elektroforeogramu po restrikčním štěpení enzymem AccI

Výsledky

Metoda CAPS dle Yaghoobi et al.,1995 umožnila amplifikaci 620bp PCR produktu u všech testovaných genotypů. Metoda byla oproti autorovi modifikována zdvojnásobením koncentrace Taq polymerázy vPCR reakci. Výsledný elektroforeogram, na kterém jsou vizualizovány PCR produkty 19 genotypů segregující generace orůdy Nema je uveden na obrázku 4. Rovněž u ostatních genotypů byl získán 620bp produkt.

Obrázek 4: Elektroforeogram PCR produktu F2 generace odrůdy Nema

S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17.18 19

1 19 testované genotypy F2 štěpící generace odrůdy Nema

S: hmotnostní standard [Lambda DNA/Eco47I (AvaII)]

Uvedený produkt byl následně restrikčně štěpen dle metodiky Yaghoobi et al. (1995) při 37 °C po dobu 150 minut. Pro restrikční štěpení bylo použito vždy 10l PCR produktu. Byly testovány pufry Standard i Tango. U žádného PCR produktu kočekávanému štěpení nedošlo. Koncentrace enzymu byla proto zvýšena až na dvojnásobek autorem deklarované koncentrace, ovšem ke štěpení opět nedošlo. Rovněž byla testována doba inkubace. Byl proveden experiment se zkrácenou dobou inkubace na 90 minut a zároveň s prodlouženou dobou na 210 minut inkubace opět s negativním výsledkem.

Diskuse a závěr

Lze konstatovat, že využití CAPS markerů pro detekci Mi genu rezistence rajčat a jeho alelické série je velmi rychlou a jednoznačnou metodou. Důležitá je ale volba vhodné metodiky. Je samozřejmostí, že metody založené na principu polymerázové řetězové reakce je nutné modifikovat dle podmínek jednotlivých laboratoří. Nejdůležitějším krokem k dosažení požadovaného výsledku jsou poznatky získané základním výzkumem, který je v oblasti molekulárních markerů rostlin v řadě případů závislý na experimentech prováděných ve vyspělých zemích zejména Evropy a USA. V případě experimentu provedeného v laboratoři genetických analýz ČZU v Praze je metoda dle Williamson et al. (1994) bezproblémovou. Tato metoda, která využívá pro digesci enzym TaqI, je dobře aplikovatelná pro detekci genu Mi vgenomu rajčete včetně určení alelické série tohoto genu. Metodu lze rovněž využít při studiu genotypů pocházejících z České republiky. Metoda dle Yaghoobi et al.(1995), která pro digesci využívá enzym AccI, neumožnila rozlišení alelické série žádného z testovaných genotypů. Chyba digesce může být způsobena celou řadou dalších faktorů, které doposud nebyly testovány. Negativní výsledek bude předmětem dalšího zkoumání.

Literatura

Fazal, M. - Shah, N.H. - Imran, M. - Siddiqui, Z.A. : Responses of some tomato cultivars to root-knot nematode Meloidogyne incognita. Tests of agrochemicals and cultivars, (15), 1994, 6, 126-127.

Kaloshian, I. - Lange, W.H. - Williamson, V.M. : An aphid-resistance locus is tightly linked to the nematode-resistance gene, Mi, in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92 (2), 1995, 1, 622-625.

Skupinová, S. - Vejl, P. Sedlák, P. - Bardová, M. - Andrlová, M. Ischiová, J.: Molecular genetic detection of Mi gene allelic configuration in various tomato genotypes. Sborník referátů "Setrvalý rozvoj rostlinné a živočišné produkce cesta krozvoji čekého venkova", 25-26.9. 2002, ČZU vPraze, 2002, 163.

Skupinová, S. - Vejl, P. Sedlák, P. - Zouhar, M. Bardová, M.: Detekce Mi genu u druhu Lycopersicon esculentum. Sborník konference "Stabilizující a omezující faktory tvorby výnosu a jakosti rostlinné produkce, 11. 12. 12. 2001, ČZU vPraze, KRV 2001, 59-65.

Vejl, P. Skupinová, S. Vopršal, J. Černý, J. Habětínek, J.: Metody molekulární analýzy přechod na vyšší stupeň šlechtění. Sborník referátů "Osivo a Sadba" 14. 2. 2001, ČZU vPraze, KRV, 2001, 76-88

Vos, P.- Simons, G.- Jesse, T.- Wijbrandi, J.- Heinen, L. - Hogers, R.- Frijters, A.- Groenendijk, J.- Diergaarde, P.- Reijans, M.- Fierens-Onstenk, J.: The tomato Mi-1 gene confers resistance to both root-knot nematodes and potato aphids. Nature biotechnology, 16(13), 1998, 10, 1365-1369.

Williamson, V.M. - Ho, J.Y. - Wu, F.F. - Miller, N. - Kaloshian, I. : A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene, Mi in tomato. Theoretical and applied genetics, 87 (7), 1994, 2, 757-763.

Yaghoobi, J. - Kaloshian, I. - Wen, Y. - Williamson, V.M. : Mapping a new nematode resistance locus in Lycopersion peruvianum. Theoretical and applied genetics, 91 (3), 1995, 8, 457-464.

Kontaktní adresa autora:

Dr. Ing. Sylva Skupinová

Katedra genetiky a obecné zootechniky, ČZU vPraze, Kamýcká 957, 165 21 Praha 6 - Suchdol

e-mail: skupinova@af.czu.cz

Práce je podporována výzkumným záměrem MSM 412100002, grantovým projektem FRVŠ G4 1102 a GA ČZU 21190/1312/213110.