MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA VYBRANÝCH HOUBOVÝCH CHOROB PŠENICE OBECNÉ (TRITICUM AESTIVUM L.)

Molecular Diagnostic of Some Fungal Diseases in Wheat (Triticum aestivum L.)

P. Vejl1, S. Skupinová1, J. Vopršal1, I. Polišenská2, M. Váňová2

1Česká zemědělská univerzita v Praze

2Výzkumný ústav zemědělský Kroměříž, s.r.o.

Abstract

In this paper is presented problem of molecular technique using for detection fungal diseases in wheat: Tapesia yallundae, T. acuformis, Fusarium avenaceum, F. culmorum, Microdochium nivale var. majus and M. nivale var. nivale. For analysis was used pure isolates of tested diseases and infected plant parts. For fungi detections were used publicated markers. All of markers were based on polymerase chain reaction (PCR). Specific bands of all fungal species were detected.

The genus Tapesia was detected in dry stems analysed before yield. The genus Fusarium was identificated in plants evaluated in April. The study of the genus Microdochium was realised in infected plants in February.

The concordance between standard and PCR methods of diseases identification was 98,7% in Tapesia acuformis, 97,5% in T. yallundae and 100% in Fusarium avenaceum, F. culmorum, Microdochium nivale var. majus and M. nivale var. nivale. Tapesia acuformis, T. yallundae, Fusarium avenaceum and F. culmorum coincidet-infection was not found.

wheat, Triticum aestivum L., fungal diseases, Tapesia yallundae, Tapesia acuformis, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Microdochium nivale var. majus a Microdochium nivale var. nivale., DNA, Polymerase Chain Reaction

Úvod

Houbové choroby představují u pšenice významnou skupinu chorob, které výrazně negativně působí na kvantitu i kvalitu produkce (Benada et al. 1981). Houbové choroby mohou obecně poškozovat kořenový sytém, paty stébel, stébla, listové pochvy a čepele, klasy i obilky pšenice. Tato skupina chorob se šíří osivem i infikovanými rostlinnými zbytky. V tomto příspěvku byly jako modelové houbové choroby pšenice zvoleny: Tapesia yallundae, T. acuformis, Fusarium avenaceum, F. culmorum, Microdochium nivale var. majus a M. nivale var. nivale. Pro rod Tapesia je charakteristické šíření infikovanými zbytky rostlin. Houbové choroby rodu Fusarium se mohou rozšiřovat jak infikovaným osivem tak i zbytky rostlin. Rod Mycrodochium se šíří osivem infikovaným konidiemi nebo obilkami, kterou jsou prorostlé mycéliem této houby (Warren a Kommedahl, 1973, Wiese, 1987). V boji proti těmto chorobám má velký význam zdravotní stav osiva a s tím spojené jeho moření a dodržování základních agrotechnických postupů. Přímá ochrana proti houbovým chorobám je založena na aplikaci širokého spektra fungicidních prostředků.

Identifikace houbových chorob pšenice je prováděna na základě vyhodnocení příznaku napadených rostlin, mikroskopickými testy nebo laboratorními kultivačními pokusy na selekčních médiích. V současné době jsou pro identifikaci houbových chorob využívány metody založené na analýzách DNA. Analýzy DNA mohou být založeny na principu hybridizace DNA patogena se specifickou značenou sondou (Nicholson et al., 1994). Variabilitu mitochondriální DNA patotypů rodu Tapesia studovali s využitím RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - délkový polymorfismus restrikčních fragmentů) techniky Nicholson et al. (1993) a Takeuchi a Kuninaga (1996).

PCR (Polymerase Chain Reaction - polymerázová řetězová reakce) metodu použili pro odlišení Tapesia acuformis od Tapesia yallundae mezi prvními Poupard et al. (1993) a Gac et al. (1996), kteří sledovali variabilitu DNA sekvence pro ribozomální ITS oblast. Pro identifikaci a současně pro kvantifikaci Tapesia acuformis a Tapesia yallundae použil specifické RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - náhodné amplifikace polymorfní DNA) markery Nicholson et al. (1997). Genetické studie na základě PCR prováděl u rodu Fusarium například Schilling et al. (1996), který odlišil F. graminareum a F. culmorum. Variabilitu u druhu Fusarium poae studoval na základě RAPD polymorfismu Kerényi et al. (1997). Shodnou metodu pro sledování variability chorob pat stébel použila také Váňová et al. (2000) a Vejl et al. (2000b). Detekci rodu Fusarium pomocí polymerázové řetězové reakce uvádí také Less 1995, Turner et al. (1998) a Vejl et al. (2000a). Variabilitu rod Microdochium zkoumali pomocí DNA markerů například Nicholson a Parry (1996).

Materiál a metody

Biologický materiál

Pro experimenty byly použity všechny izoláty rodů Tapesia, Fusarium a Microdochium. Získání izolátů popisuje Vejl et al. (2000b). U druhu Tapesia yallundae bylo použito 80 izolátů, u druhu Tapesia acuformis 75 izolátů, u druhu Fusarium avenaceum 27 izolátů, u druhu Fusarium culmorum 22 izolátů a u druhu Microdochium nivale 24 izolátů.

Stébla infikovaná houbami rodu Tapesia yallundae, Tapessia acuformis (celkem 934 infikovaných rostlin) byla získána z různých lokalit České republiky. Přezimující rostliny (celkem 123 rostlin) napadené houbami rodu Tapesia a Fusarium pocházely rovněž z různých lokalit České republiky. Rostliny (celkem 137 rostlin) napadené plísní sněžnou (Microdochium nivale) pocházely z experimentálního pole ČZU v Praze.

Izolace DNA

Pro izolaci DNA bylo použito modifikované metody dle Saghai-Maroof et al. (1984). DNA byla izolována z nárůstu mycélia na Petriho misce o průměru 85mm a z částí infikovaných rostlin. Modifikovanou metodu izolace popisuje Vejl et al. (2000b). Kvalita DNA byla testována elektroforeticky.

Amplifikace DNA - PCR

Pro amplifikaci DNA byla použita metoda specifické PCR o objemu 25m l, která probíhala v termocykleru Cyclogene (Techne, Velká Británie). Pro identifikaci patogenů byly použity následující dvojice primerů, které použili níže citovaní autoři:

Tapesia yallundae (Nicholson et al.,1997)

Ty16F 5GCGCTGGAAAAAGAGGACTG3

Ty16R 5TGGAAGGGTCTTGCAGGG3

Tapesia acuformis (Nicholson et al.,1997)

Ta05F 5GTATCGGACGGAGATCCAGC3

Ta05R 5TTGCTCAGTGCATTGTCGG3

Fusarium avenaceum (Less, 1995)

AF 5CAAGCATTGTCGCCACTCTC3

AR 5GTTTGGCTCTACCGGGACTG3

Fusarium culmorum (Less, 1995)

FcF 5CAAAAGCTTCCCGAGTGTGTC3

FcR 5GGCGAAGGTTCAAGGATGAC5

Microdochium nivale var. majus (Nicholson a Parry, 1996)

Mnm2F 5TGCAACGTGCCAGAAGCT3

Mnm2R 5AATCGGCGCTGTCTACTAAAAGC3

Microdochium nivale var. nivale (Nicholson et al., 1996)

Y13NF 5accagccgatttgtggttatg3

y13nr 5ggtcacgaggcagagttcg3

Modifikované složení reakce pro identifikaci druhů rodu Tapesia, Fusarium i Microdochium bylo následující: templátová DNA 100,0ng.25m l-1, oba primery 100nM, rekombinantní Taq polymeráza (MBI Fermentas, Litva) 0,7U.25m l-1, dNTP 100m M, MgCl2 1,5mM, Tris-HCl (pH8,8) 10mM, KCl 50mM, Nonidet P40 0,08

Pro amplifikaci DNA rodu Tapesia byl použit následující teplotní a časový profil:

5 cyklů (95,0oC-30s, 66oC-20s, 72 oC-45s)

15 cyklů (95,0oC-30s, 64oC-20s, 72oC-45s)

25 cyklů (95,0oC-30s, 62 oC-20s, 72 oC-45s)

1cyklus (72oC-300s).

Pro amplifikaci DNA rodu Fusarium byl použit následující teplotní a časový profil:

40 cyklů (95,0oC-30s, 60oC-30s, 72oC-40s)

1cyklus (72oC-300s).

Pro amplifikaci DNA rodu Microdochium byl použit následující teplotní a časový profil:

40 cyklů (95,0oC-30s, 61oC-30s, 72oC-40s)

1cyklus (72oC-300s).

Specifické PCR markery byly separovány na horizontální elektroforéze Sub Cell (Bio Rad, USA) v 1,5% agarózovém gelu při konstantní hodnotě 100V (3,3V na 1cm vzdálenosti mezi elektrodami) po dobu 150 minut. Pro elektroforézu byl použit TBE pufr. Pro vizualizaci bylo použito barvivo ethidium bromid. Pro fotodokumentaci byla použita digitální fotokamera Camedia C-1400L (Olympus, Japonsko).

Výsledky a diskuse

Izolace DNA

Zvolená metoda poskytovala vysokomolekulární DNA v dostatečném množství a kvalitě vhodné pro následnou amplifikaci. Vzhledem k tomu, že při izolaci DNA patogena z infikované rostliny byla současně izolována genomová DNA hostitele, bylo nutno ve srovnání s citovanými autory zvýšit množství templátové DNA v PCR na 100ng.25m l-1.

Specifické PCR markery rodů Tapesia, Fusarium a Microdochium

Veškeré modifikace publikovaných metodik v podmínkách LGA ČZU v Praze probíhaly na souboru taxonomicky známých izolátů. Následně byly tyto patogeny detekovány na infikovaných rostlinách v těchto kategoriích:

Odlišení Tapesia yallundae a Tapesia acuformis - suchá stébla odrůd Boka, Brea, Bruta, Contra, Ebi, Hana, Mona, Rexia, Samanta, Saskia, Siria, Soldana, Šárka a Versailles (odběr těsně před sklizní)

Odlišení rodu Tapesia a rodu Fusarium - infikované pochvy pat stébel odrůd Hana, Samanta a Siria (odběr v dubnu)

Odlišení variet Microdochium nivale - infikované pochvy stébel odrůd Brea, Hana a Siria (odběr v únoru).

Na následujících obrázcích jsou znázorněny vzorové elektroforeogramy specifických PCR markerů.

Obrázek 1: Elektroforeogram PCR markerů při použití primerů Ty16F/Ty16R pro detekci Tapesia yallundae

Tapesia Fusarium

yallundae acuformis avenaceum culmorum

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S

Poznámka: S - Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Obrázek 2: Elektroforeogram PCR markerů při použití primerů AF/AR pro detekci Fusarium avenaceum

Tapesia Fusarium

yallundae acuformis avenaceum culmorum

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S

Poznámka: S - Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Obrázek 3: Elektroforeogram PCR markerů při použití primerů Mnm2F/Mnm2R pro detekci Microdochium nivale var. majus

Microdochium nivale

var. majus var. nivale neinfikované rostliny

a b c d e f g h i j k l S

Poznámka: S - Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

Specificita použitých markerů byla před vlastními experimenty ověřena amplifikací izolátů studovaných taxonů. Experimentálně bylo rovněž potvrzeno, že při použití templátové DNA z neinfikovaných rostlin pšenice amplifikace neprobíhala. Identifikace patogenů - specifické PCR probíhaly podle následujícího schématu:

primery Ty16F/Ty16R poskytují 1005bp fragment specifický pouze pro Tapesia yallundae

primery Ta05F/Ta05R poskytují 330bp fragment specifický pouze pro Tapesia acuformis

primery AF/AR poskytují 920bp fragment specifický pouze pro Fusarium avenaceum

primery FcF/FcR poskytují 700bp fragment specifický pouze pro Fusarium culmorum

primery Mnm2F/Mnm2R poskytují 750bp fragment specifický pouze pro Microdochium nivale var. majus

primery Y13NF/Y13NR poskytují 310bp fragment specifický pouze pro Microdochium nivale var. nivale

Přehled o výsledcích identifikace patogenů pomocí specifických PCR primerů podávají grafy 1 a 2.

Graf 1: Porovnání shody standardních identifikačních metod s metodami molekulární diagnostiky založenými na PCR

Z grafu 1 vyplývá, že u izolátů identifikovaných kultivačními testy jako Tapesia yallundae, bylo pomocí PCR metod nalezeno 2,5% izolátů druhu Tapesia acuformis. U druhu Tapesia acuformis bylo naopak PCR diagnostikou identifikováno 1,3% druhu Tapesia yallundae. Ve všech případech se jednalo o izoláty pocházející z roku 1997. U druhů Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum a Microdochium nivale byla 100% shoda mezi oběma identifikačními postupy.

Pro identifikaci byla použita pouze stébla s morfologicky typickými příznaky napadení stéblolamem - houbami rodu Tapesia.

Z grafu 2 vyplývá, že pomocí zvolené PCR techniky molekulární diagnostiky nebyly ani v jednom případě nalezeny kombinace současného napadení rostlin třemi houbami - obecně rodem Tapesia sp., Fusarium avenaceum a Fusarium culmorum.

Graf 2: Identifikace původců chorob stébel ozimé pšenice provedená na počátku vegetačního období (duben) pomocí specifické PCR

Záver

Výsledky provedených experimentů je možno shrnout do následujících bodů:

Byly vybrány publikované postupy pro aplikaci metod specifické molekulární diagnostiky vybraných houbových chorob pšenice v podmínkách Laboratoře genetických analýz ČZU v Praze.

Vhodnost těchto metod a jejich vysoká specifičnost byla ověřena na širokém souboru izolátů.

Byly navrženy optimalizované metody detekce Tapesia yallundae, Tapesia acuformis, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum a Microdochium nivale pomocí specifické PCR přímo na infikovaných rostlinách.

Navržené metody jsou vhodné pro jednoznačnou detekci studovaných původců chorob pat stébel ozimé pšenice.

Ze získaných výsledků lze vyvodit následující závěry:

Izoláty hub rodu Tapesia, Fusarium a Microdochium

U izolátů byly pomocí molekulární PCR detekce stanoveny 2 izoláty (2,5% ze všech izolátů) Tapesia acuformis, které byly kultivační identifikační metodou určeny jako Tapesia yallundae. Rovněž byl pomocí PCR detekován 1 izolát (1,3% ze všech izolátů) Tapesia yallundae, který byl standardní metodou stanoven jako Tapesia acuformis. U zbývajících taxonů (rod Fusarium a Microdochium) byla 100% shoda mezi oběma metodami identifikace.

Stébla infikovaná houbami rodem Tapesia

U stébel rostlin napadených rodem Tapesia převažovalo napadení Tapesia yallundae (52,4% ze všech identifikovaných infekcí) nad napadením druhem Tapesia acuformis (38,3% ze všech identifikovaných infekcí). Současné napadení oběma druhy rodu Tapesia bylo pomocí PCR detekováno pouze v 9,3% případů.

Choroby báze stébel na počátku vegetačního období

Pomocí PCR detekční techniky byla zjištěna výrazná převaha napadení rodem Tapesia (67,5% případů) nad infekcí rodem Fusarium (17,3% případů). Současné napadení oběma rody chorob pat stébel bylo zjištěno pouze u 15,2% případů. Podrobné rozdělení druhů vyvolávajících choroby bází stébel je uvedeno v grafu 2.

Rostliny napadené plísní sněžnou (Microdochium nivale)

Na základě PCR diagnostiky byla stanovena vyšší četnost výskytu Microdochium nivale var. majus (51,5% případů) oproti var. nivale (43,1% případů). Oběma varietami bylo současně napadeno pouze 5,4% případů.

Podekování

Rád bych tímto způsobem vyjádřil poděkování všem vědeckotechnickým pracovníkům a studentům ČZU v Praze, zejména Ing. E. Korbelové, Ing. M. Růžičkové, P.Sedlákovi, J. Korytové, L. Jiráskové a P. Kozlové , kteří se podíleli na realizaci technického zázemí nezbytného pro realizaci náročných experimentů.

Výsledky experimentů v tomto příspěvku byly získány za podpory grantového projektu GAČR 522/97/0636 “Detekce a identifikace původce stéblolamu Pseudocercosporella herpotrichoides užitím metod polymerázové řetězové reakce” a MSM 412100002 - výzkumný záměr “Stabilizující a omezující faktory tvorby výnosu a jakosti produkce”.

Literatura

BENADA, J. - VÁŇOVÁ, M. - PEŠÍK, J.: Průběh napadení ozimé pšenice stéblolamem a efektivita chemické ochrany. Rostlinná výroba, 27, 1981, 131-142.

GAC, M. L. - MONTFORT, F. - CAVALIER, N. - SAILLAND, A.: Comparative study of morphological, cultural and molecular markers for the characterisation of Pseudocercosporella herpotrichoides isolates. European Journal of Plant Pathology. 1996, 102, 325-327.

KERÉNYI, Z. - TÁBORORHEGYI, É. - POMÁZI, A. - HORNOK, L.: Variability amongst strains of Fusarium poae assessed by vegetative compatibility and RAPD polymorphism. Plant Pathology, 46, 1997, 882-889.

LESS, A. K.: Diagnosis and Control of Root Rot Pathogens of Wheat. Buckinghamshire, UK, Open University, PhD thesis, 1995.

NICHOLSON, P. - REZANOOR, H. N. - HOLLINS, T. W.: Classification of word-wide collection of isolates of Pseudocercosporella herpotrichoides by RFLP analysis of mitochondrial and ribosomal DNA and host range. Plant Pathology. 42, 1993, 58-66.

NICHOLSON, P. - PARRY, D. W.: Development and use of a PCR assay to detect Rhizoctonia cerealis, the cause of sharp eyespot of wheat. Plant Pathology, 45, 1996, 872-883.

NICHOLSON, P. - REZANOOR, H. N. - SIMPSON, D. R. - JAYCE, D.: Differentiation and quantification of the cereal eyespot fungi Tapesia yallundae and Tapesia acuformis using a PCR assay. Plant Pathology, 46, 1997, 842-856.

Nicholson, P. - Rezanoor, H.N. - Hollins, T.W.: The identification of a pathotype-specific DNA probe for the R-type of Pseudocercosporella herpotrichoides. Plant Pathology, 43, 1994, 694-700.

POUPARD, P. - SIMONET, P. - CAVALIER, N. - BARDIN, R.: Molecular characterisation of Pseudocercosporella herpotrichoides isolates by amplification of ribosomal DNA internal transcribed spacers. Plant Pathology, 1993, 42, 403-412.

SAGHAI-MAROOF, M. A. - SOLIMAN, K. M. - JORGENSEN, R.A. - ALLARD, R.V.: Ribosomal DNA spacer-lenght polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proceeding of the National Academy of Sciences, USA, 81, 1984, 8014-8019.

SCHILLING, A. G. - MÖ LLER, E. M. - GEIGER, H. H.: Polymerase chain reaction-based assays for specific detection of Fusarium culmorum, F. graminareum and F. avenaceum. Phytopathology, 86, 1996, 515-522.

TAKEUCHI, T. - KUNINAGA, S.: Determination of relationships in Pseudocercosporella herpotrichoides by analysis of mitochondrial DNA. Mycological Research, 100, 1996, 693-701.

TURNER, A. S. - LEES, A. K. - REZANOOR, H. N. - NICHOLSON, P.: Refinement of PCR-detection of Fusarium avenaceum and evidence from DNA marker studies for phenetic relatedness to Fusarium tricinctum. Plant Pathology, 47, 1998, 278-288.

Váňová, M. - Polišenská, I. - Vejl, P. - Skupinová, S.: Differentiation of cereal eyespot fungi using morphologic characteristic and PCR diagnostic tests. Plant Protection, 36(2), 2000, 57-64.

Vejl, P. - Skupinová, S. - Polišenská, I. - Váňová, M.: Distinguishing isolates of cereal stem disease pathogens of the genus Tapesia from isolates of Fusarium and Rhizoctonia using the RAPD method. Plant Protection Science, 36(4), 2000b, 132-140.

Vejl, P. - Skupinová, S. - Vopršal, J.: Detekce Fusarium culmorum v infikovaných klasech a obilkách pomocí specifické PCR. Zamyšlení nad rostlinnou výrobou 2000 - 10. konference, ČZU v Praze, 2000a, 242-246.

WARREN, H. L. - KOMMEDAHL, T.: Fertilization and wheat refuse effects on Fusarium species associated with wheat roots in Minnesota. Phytopathology, 63, 1973, 103-108.

WIESE, M. V.: Compendium of Wheat Diseases. Second edition. APS Press, The American Phytopathological Society, Minnesota, 1987.