VYUŽITÍ RAPD METODY PRO ODLIŠENÍ ODRŮD JEČMENE JARNÍHO (HORDEUM VULGARE L.) S IDENTICKÝMI HORDEINOVÝMI A ENZYMATICKÝMI SPEKTRY

Using of RAPD method for spring barley varieties diferentiation (Hordeum vulgare L.) with identical hordeine and enzyme spectra

Jiří Vopršal, Jiří Černý, Sylva Skupinová, Pavel Vejl

Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract

Genetic markers based on RAPD were used for distinguishing spring barley varieties (Hordeum vulgare L.) with identical hordeine and esterase spectra. 109 primers were tested. Two primers amplificated three polymorphous bands, which distinguished Krystal and Novum varieties. Galan and Pax varieties had two polymorphous bands. These bands were amplificated with next tested primer.

Hordeum vulgare L., spring barley, molekular marker, DNA polymorphism, RAPD method

Úvod

Mezi nekonvenční šlechtitelské postupy a metody používané v praktickém šlechtění lze zařadit vedle celého komplexu biotechnologických a molekulárně biologických technik také genetické mapování a selekce na úrovni molekulárních markerů. Tato oblast metod využívá metodických postupů molekulárního fingerprintingu pro hodnocení šlechtitelského materiálu - hodnocení homogenity a homozygotnosti inzuchtních a dihaploidních linií, charakteristiku, popis a identifikaci šlechtitelského materiálu na molekulární úrovni. U řady zemědělských plodin existuje velké množství odrůd a jejich rozlišení jen pomocí morfologických a fyziologických znaků a vlastností je problematické.

Uvedením metod molekulární biologie do této oblasti umožňuje využití různých bílkovinných a enzymových systémů jako biochemicko-genetických markerů nebo stále častěji využívaných DNA markerů založených na polymorfismu DNA - např. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaktion - Random Amplified Polymorphic DNA), markery založené na polymorfismu počtu tandemových repeticí - mini- a mikrosatelitní DNA, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).

Prolaminové bílkoviny ječmenného zrna - hordeiny - se vyznačují dostatečným genetickým polymorfismem, vysokou expresivitou a penetrací (Sozinov a Poperelja, 1979). Tyto vlastnosti hordeinových bílkovin dávají předpoklady jejich využití nejen k rozlišení a identifikaci jednotlivých genotypů ječmene (Pomorcev et al., 1985; Šašek et al., 1991; Černý et al. 1998) , ale představují významné markery pro některé hospodářsky významné znaky a vlastnosti, které se nacházejí ve vazbě s hordeinovými lokusy v chromozómu 5 (Shewry et al., 1983; Děmina a Necvetajev, 1984; Černý et al., 1999). Vzhledem k vysokému stupni genetické příbuznosti současných intenzivních odrůd ječmene a lokalizace hordeinových genů v jednom chromozómu je pro identifikaci odrůd ječmene vhodné současné používání metod elektroforézy hordeinů a některých enzymových systémů.

Metody analýzy izoenzymů pomocí elektroforézy na gelovém nosiči (škrobu nebo polyakrylamidu) se stále využívá k identifikaci odrůd (Nielsen a Johansen, 1986). Sýkorová a Hadačová (1992) charakterizovaly některé hordeinově identické odrůdy ze sortimentu československých jarních a ozimých odrůd ječmene pomocí izoenzymů esteráz v zrně. V některých případech došlo elektroforézou enzymů k jejich vzájemnému rozlišení. V polyakrylamidovém gelu pomocí standardních odrůd byly definovány alely esterázových lokusů Est1, Est2, Est4, a Est5 z listů ječmene (Sýkorová, 1995).

RFLP markery byly použity pro popis substitučních linií odvozených z křížení Hordeum vulgare L. a Hordeum bulbosum L. (Timmerman et al., 1993; Pickering et al., 1997). Genetickou variabilitu kulturního a planého ječmene (Hordeum vulgare ssp. vulgare a Hordeum spontaneum) zjišťoval Petersen et al. (1994) použitím RFLP metody. Soubor odrůd evropského a asijského původu byl analýzou rozdělen do pěti skupin zohledňující geografický původ odrůd. Statistickou analýzou vykazovaly linie H. spontaneum vyšší variabilitu uvnitř skupiny než odrůdy H. vulgare ssp. vulgare.

PCR markerů se často využívá v oblasti genetického “fingerprintingu”, kdy rozdíly mezi genotypy ječmene na úrovni druh, poddruh, odrůda, linie atd. jsou detekovány na základě odlišnosti DNA (Manninen a Nissila, 1997; Baum et al., 1997; Hang et al., 1998; Kraicet et al., 1998; Michaels a Amasino, 1998). Hoffman a Bregitzer (1996) použili PCR-RAPD techniky pro stanovení genetické variability čtyř odrůd šestiřadých sladovnických ječmenů. Z 80 použitých dekamerických primerů vybrali 9 primerů pro RAPD markery, které opakovaně identifikovaly všechny genotypy.

Pro vysokou spolehlivost výsledků je studium SSR markerů vhodné pro DNA “fingerprinting” jako základ klasifikace odrůd a potvrzení pravosti osiva nebo získaných produktů (Vershinin et al., 1994; Rö der et al., 1995; Blake et al., 1996; Busch et al., 1996; Tsujimoto et al., 1997). Russell et al. (1997) provedl SSR analýzu 12 odrůd ozimého a 12 odrůd jarního ječmene. Mikrosatelitní DNA detekoval 14 páry specifických primerů o 18 - 26 bp. Elektroforetickou separací amplifikovaných fragmentů získal polymorfní markery, které spolehlivě odlišily genotypy odrůd ječmene. Sánchez de la Hoz et al. (1996) provedl “fingerprinting” 14 evropských odrůd ječmene. Různé dekamerické oligonukleotidy nesoucí dinukleotidové motivy [ GT(CA)4 nebo GC(CA)4] byly kombinovány s dekamerickými primery náhodné sekvence. Produkty satelitní DNA byly separovány v polyakrylamidovém gelu. Získané elektroforeogramy byly následně statisticky analyzovány a vyhodnoceny. William et al. (1997) použil mikrosatelitních markerů k rozlišení odrůd sladovnického a krmného typu. Testováno bylo celkem 38 SSR markerů, 17 markerů detekovalo polymorfní lokusy u použitého souboru odrůd.

Materiál a metody

Biologický materiál

Pro experimentální práci byly ze současně pěstovaných odrůd jarní formy ječmene obecného (Hordeum vulgare L.) vybrány dvě dvojice odrůd, které vykazovaly identická elektroforetická spektra jak ve skladbě hordeinových, tak i ve skladbě enzymatických bílkovin. První dvojici tvořily analyzované odrůdy Novum a Krystal vyznačující se totožnými výše uvedenými spektry, druhou dvojici představují odrůdy Galan a Pax, rovněž identické ve svých hordeinových a esterázových spektrech. Klíční rostliny získané naklíčením obilek na filtračním papíře v Petriho miskách byly kultivovány za přirozeného světla při laborotorní teplotě. Pro izolaci DNA byly klíční rostliny odebírány ve stáří 5 dnů. Od každé odrůdy bylo náhodně vybráno po 5 klíčencích.

DNA byla izolována modifikovanou metodou dle Saghai-Maroof et al. (1984) za použití CTAB (cetyltrimetylbromid amonný) extrakčního pufru. RNA byla enzymaticky degradována. DNA byla po enzymatické degradaci RNA purifikována směsí fenolu a chloroformu, následně srážena 80% etanolem a rozpuštěna a uchovávána v 1x TE (Tris-EDTA) pufru. Pro stanovení koncentrace a celkového množství DNA v roztoku bylo použito UV spektrofotometrické absorpční metody. Čistota izolované DNA byla zjištěna na základě poměru absorbance DNA (A260=260nm) a proteinů (A280=280nm). Kvalita izolované DNA byla ověřena pomocí elektroforetické separace v 0,8% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze.

Amplifikace DNA

Amplifikace DNA u vybraných odrůd proběhla podle teplotního a časového profilu uvedeného v tabulce 1.

Tabulka 1: Teplotní a časový profil RAPD reakce

Poznámka: maximální čas odpovídá maximálnímu nastavení času v programu termocykleru (99h59min59s)

Chemické složení RAPD reakce

Složení reakčních komponent pro 50m l reakci bylo následující: templátová DNA 40ng, vybraný primer 30ng, rekombinantní Taq polymeráza (MBI Fermentas, Litva) 1,5U, dNTP 100m M, MgCl2 1,5mM, Tris Hcl (pH 8,8) 10mM, Kcl 50mM, Nonidet P40 0,08%. Reakční směs byla převrstvena 15 m l minerálního oleje. Pro amplifikaci byl použit termocykler (Cyclogene Techne, Velká Británie). RAPD produkty byly separovány v 1,5% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze při konstantní hodnotě napětí 100V po dobu 150 minut. Separované amplifikované fragmenty byly barveny ethidium bromidem a vizualizovány na UV transiluminátoru. Získané elektroforeogramy byly digitalizovány fotokamerou Camedia C 1400L (Olympus, Japonsko). Korekce ostrosti pozadí a drah elektroforeogramů byly upraveny programem iPhoto Plus version 1.1. a uloženy v podobě * .TIF souborů.

Výsledky a diskuse

Z navažovaného množství rostlinného materiálu, který dosahoval 30 - 50 mg čerstvé hmoty, bylo izolováno dostatečné množství DNA pro RAPD analýzy. Poměr absorbance A260/280, vyjadřující čistotu DNA, dosahoval hodnot v rozpětí 1,7-2,1.

Pro odlišení studovaných odrůd, na základě jejich rozdílné sekvence DNA byl testován soubor 109 oligonukleotidů, jejichž délka dosahovala 8 - 11 bp. Z tohoto počtu primerů pouze dva umožnily odlišit odrůdy Krystal a Novum a jeden primer amplifikoval polymorfní zóny u odrůd Galan a Pax.

Výsledek po elektroforetické separaci RAPD produktů znázorňuje obrázek 1. Dráhy označené 1 až 5 představují separované produkty po RAPD amplifikaci od každého individuálního klíčence odrůdy Krystal, dráhy číslo 6 - 10 označují separované produkty pěti individuálních rostlin odrůdy Novum (obrázek 1). Použitý dekamerický primer amplifikoval dvě polymorfní zóny o přibližné velikosti 1420bp, resp. 780 bp. Obě tyto polymorfní zóny se vyskytovaly pouze u odrůdy Krystal.

Obrázek 1:Elektroforeogram RAPD produktů amplifikovaných primerem 5´-GGT GAC GCA G-3´ u odrůd Krystal a Novum, (šipkou je označena polymorfní zóna, S - Lambda DNA/Eco471(AvaII))

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Rovněž druhý použitý dekamer umožnil amplifikaci polymorfního lokusu vyskytujícího se pouze u odrůdy Novum. U odrůdy Krystal nebyla tato polymorfní zóna přítomna. Tento RAPD fragment dosahoval velikosti přibližně 420bp - obrázek 2.

U druhé dvojice odrůd Galan a Pax bylo také pomocí DNA markerů s využitím RAPD metody dosaženo jejich vzájemného odlišení. Primer, který nesl sekvenci 5´-GTG ACA GGC T-3´ amplifikoval dva specifické DNA fragmenty. Delší fragment, jehož velikost byla přibližně 800bp, se vyskytoval pouze v dráze číslo 6 až 10, jež představují pět individuálně analyzovaných rostlin odrůdy Pax. Přítomnost druhé polymorfní zóny v dráze elektroforeogramu číslo 1 - 5 naznačuje, že se tato amplifikovaná, použitým primerem ohraničená sekvence, nachází pouze u odrůdy Galan. Délka amplifikovaného produktu dosahovala asi 650 bp - obrázek 3.

Obrázek 2:Elektroforeogram RAPD produktů amplifikovaných primerem 5´-CTG CTG GGA C-3´ u odrůd Krystal a Novum, (šipkou je označena polymorfní zóna, S - Lambda DNA/Eco471(AvaII))

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Obrázek 3:Elektroforeogram RAPD produktů amplifikovaných primerem 5´-GTG ACA GGC T-3´ u odrůd Galan a Pax, (šipkou je označena polymorfní zóna, S - Lambda DNA/Eco471(AvaII))

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Získané výsledky nebylo možné porovnávat s pracemi uvedených autorů, protože žádný z nich nepoužil DNA analýzu na základě RAPD metody. Výsledky publikované Černým a Šaškem (1998) a rovněž práce Sýkorové a Hadačové (1992) a Sýkorové (1995) ukazují na nutnost využití dalších markerovacích systémů v případech, kde bílkovinné genetické markery neposkytují dostatečnou záruku posouzení odrůdové pravosti a čistoty a identifikace odrůd. Například odrůdy Krystal a Novum, resp. Galan a Pax jsou charakterizovány stejnými hordeinovými alelickými bloky či zónami: HRD A32 B21 C0, resp. HRD A2 B19 C1 a stejnou skladbou alel esterázových lokusů: Est Ca-Un-Nz-Pi, resp. Est Pr-Fr-Su-Pi. Tato práce potvrdila vhodnost využití RAPD metody pro charakterizaci odrůd a šlechtitelského materiálu na základě DNA markerů. Linc et al. (1996) a Nevo et al. (1997) rovněž shodně konstatují, že RAPD se jeví jako velmi efektivní metoda pro studium genetické variability ječmene obecného (Hordeum vulgare L.).

Záver

Modifikovaná metodika izolace DNA podle Saghai-Maroof et al. (1984) poskytovala dostatečné množství templátové DNA, jejíž kvalita byla vhodná pro využití RAPD reakci. Výhodou pro tuto modifikovanou metodu izolace DNA byla minimální náročnost na množství rostlinného materiálu. Na základě vybraných primerů poskytujících specifické produkty lze RAPD markery použít pro stanovení genetických rozdílů mezi odrůdami a jejich identifikaci. Zvláště výhodné a možné se využití těchto DNA analýz jeví v oblasti stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty dávek osiv a merkantilu.

Literatura

Citovaná literatura je k dispozici u autorů příspěvku.