MOŽNOSTI VYUŽITÍ MOLEKULÁRNÍ GENETIKY V REZISTENTNÍM ŠLECHTĚNÍ VEGETATIVNĚ MNOŽENÝCH ZEMĚDĚLSKÝCH PLODIN

Possibility of Molecular Genetics Application in Resistant Breeding of Vegetative Propagated Crops

P. Vejl1, S. Skupinová1, J. Vopršal1, L. Nesvadba2,J. Patzak2, J. Domkářová3, P. Sedlák1, H. Drahošová1, J. Blažek4, V. Gaar5

1Česká zemědělská univerzita v Praze

2Chmelařský institut s.r.o., Žatec

3Výzkumný ústav bramborářský s.r.o., Havlíčkův Brod

4Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský s.r.o., Holovousy

5Státní rostlinolékařská správa, Praha

Abstract

Markers assisted selection (MAS) is a new trend in breeding of many crops. In this paper is present a possibility how use MAS in breeding of vegetative propagated plants. These DNA markers were optimised in Laboratory of Genetic Analysis in Czech University of Agriculture in Prague. For this problem demonstration were selected three crops: potatoes, apples and hops. In genus Solanum were used two specific PCR markers. These markers enabled the resistance genes against Ro1 patotype of potato cyst nematode (Globodera rostochiensis). First marker is the marker of mitochondrial gen for NADH dehydrogenase (part I). Second marker is the marker of gene for enzyme ribuloso-bisphosphate carboxylase (large part). RAPD markers were also used for variability study in genus Globodera. In apples were applicated dominantly and codominantly markers for detection. The Vf gene caused apple resistance against scrab (Venturia inaequalis CKE.). In hop was studied RAPD markers whish associated with degree of hop resistance against downy mildew (Peronoplasmopara humuli). The markers which are presented in this paper are used by breeders for new varieties creation.

potatoes, Solanum sp., apple, Malus sp., hop, Humulus sp., potatoe cyst nematode, Globodera sp., apple scrab, Venturia inaequalis CKE, downy mildew, Peronoplasmopara humuli, resistance, DNA markers, PCR, RAPD, breeding

Úvod

Současný rozvoj genetiky na molekulární úrovni se odráží rovněž v inovaci šlechtitelských postupů. Genetická výbava rostlin není posuzována pouze na základě sledování fenotypů a jejich segregace v hybridologických analýzách, ale je vhodně doplněna detekcí konkrétních genů pomocí DNA markerů. Molekulárně genetické markery hospodářsky významných vlastností je možno u rostlin aplikovat v různých ontogenetických fázích. Jsou nedestruktivní. To znamená, že analyzovaná rostlina není poškozena a je použitelná v dalších krocích šlechtitelského procesu. Společným znakem DNA markerů je přímá schopnost detekce alelických variant v sekvenci nukleotidů (Tanksley,1983).

Cílem tohoto příspěvku je stručné seznámení odborné veřejnosti s využitím genetických markerů založených na principu polymerázové řetězové reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction) v rezistentním šlechtění vegetativně množených rostlin, které jsou studovány v Laboratoři genetických analýz agronomické fakulty České zemědělské univerzity v Praze.

Problematika využití genetických markerů ve šlechtitelském procesu (MAS, Marker Assisted Selection) je v tomto příspěvku demonstrována na:

· detekci genů rezistence brambor vůči Ro1 patotypu háďátka bramborového (Globodera rostochiensis)

· detekci Vf genu rezistence jabloní vůči strupovitosti (Venturia inaequalis CKE.)

· vyhledávání RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markerů pro rezistenci chmele vůči peronospoře chmelové (Peronoplasmopara humuli).

Rezistence brambor vůči Ro1 patotypu háďátka bramborového a molekulárně genetická taxonomie rodu Globodera

Pro detekci genů rezistence jsou využívány PCR markery. Leister et al. (1997) uvádí několik DNA markerů, kterými lze bezpečně identifikovat rezistenci brambor k Ro1 patotypu Globodera rostochiensis. Jedná se o následující DNA markery: gen pro velkou podjednotku enzymu ribulózo-bisfosfát karboxylázy (rbcL), mitochondriální gen pro podjednotku I enzymu NADH-dehydrogenázy (nad9), lokusy GP516 lokalizované na chromozómech VII, X a XII, lokus 3.3.2. lokalizovaný na chromozómu VII, lokus 3.3.4. lokalizovaný na chromozómu VII, lokusy 1.1. lokalizované na chromozómech III a XI, lokusy 1.2.1. lokalizované na chromozómech II a XI a lokus 1.2.3. lokalizovaný na chromozómu II.

Selekce rezistentních jedinců a ověřování nalezených markerů je nezbytně spojená s jednoznačnou identifikací druhů a patotypů háďátek rodu Globodera. Na prvopočátku snah o charakteristiku populací háďátek byly, kromě biologických metod (kultivace na citlivých odrůdách Solanum tuberosum), metody biochemické. Například izoelektrická fokusní analýza (Fox a Atkinson, 1984), elektroforéza proteinů (Bakker et al., 1988) a 2D-elektroforéza proteinů (Bakker a Bouwman-Smits, 1988). Dále jsou používány metody imunologické (ELISA), metody s využitím monoklonálních protilátek (Schots et al., 1989), a analýzy DNA, jako RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) (Burrows, Boffey, 1986; Schnick, Rupenhorst, Burgermeister, 1990). Od počátku let devadesátých se používají metody založené na PCR (Polymerase Chain Reaction).

Rezistence jabloní vůči strupovitosti (Venturia inaequalis CKE.) řízená genem Vf

Studovaný majorgen rezistence Vf byl do odrůd jabloní převeden mezidruhovou hybridizací Malus x domestica x Malus floribunda. Složitým kombinačním křížením byly získány rezistentní odrůdy. Rezistence je determinována dominantně homozygotní nebo heterozygotní sestavou genu Vf. Recesivní homozygoti jsou ke strupovitosti senzitivní. Gardiner et al. (1995) studovala rezistenci vůči Venturia inaequalis CKE. u hybridů Malus x domestica (BORKH.) x Malus floribunda. Byly získány RAPD markery, které umožnily detekovat část genomu Malus floribunda, která se nacházela v hybridních genotypech a zajišťovala jejich rezistenci. Pomocí speciálních mapovacích programů byl vybrán marker, který je lokalizován 28cM od majorgenu Vf. Následnou hybridologickou analýzou a polními infekčními testy bylo potvrzeno, že tento gen se nacházel u všech rezistentních genotypů. Přehled různých genetických markerů, které lze využít ve šlechtění jabloní podává Kellerhals et al. (1996). Podobnou problematiku popisuje Gessler et al. (1997) a Gygax et al. (1997).

Gianfranceschi et al. (1996) získal dva RAPD (náhodně amplifikovaná polymorfní DNA) markery pro geny rezistence rodu Malus vůči strupovitosti. Jeden z těchto markerů umožnil detekovat hlavní gen rezistence - majorgen Vf. Tento gen byl zjištěn ve všech analyzovaných rezistentních odrůdách jabloní. Pomocí výše uvedené molekulárně genetické metody byl zjištěn rovněž gen Vr, který byl detekován u rezistentní odrůdy jabloně Nova Easygro. Gianfranceschi et al. (1996) současně navrhl způsob využití těchto markerů při selekci v praktickém šlechtitelském procesu.

Rezistence chmele vůči peronospoře chmelové (Peronoplasmopara humuli)

Vzhledem k biologii chmele (dvoudomá rostlina) a s tím spojeným vysokým stupněm heterozygotnosti je markerování hospodářských vlastností poměrně obtížné. V celosvětovém měřítku nejsou doposud publikovány žádné DNA markery rezistence chmele vůči peronospoře. Vyhledávání asociačních vztahů mezi výskytem RAPD polymorfizmu (Brady et al., 1996, Pillay a Kenny, 1996, Vejl, 1997) a stupněm odolnosti je jednou z možností nalezení DNA markerů odolnosti nebo senzitivity chmele k této chorobě.

Materiál a metody

Biologický materiál

Pro optimalizaci těchto markerů byly u výše uvedených zemědělských plodin vytvořeny kolekce genotypů s předpokládanou rezistencí a senzitivitou ke studovaným škůdcům a chorobám. Přehled použitých genotypů je uveden v následujících tabulkách.

Tabulka 1: Analyzované genotypy brambor

Tabulka 2: Analyzované genotypy jabloní

Tabulka 3: Analyzované genotypy chmele

Izolace DNA

Pro izolaci DNA byla u všech modelových rostlinných druhů použita modifikovaná metoda podle Saghai-Maroof et al. (1984): Metoda využívá extrakční pufr s cetyltrimetyl amonium bromidem. RNA byla z izolátů odstraněna enzymaticky. DNA byla UV-spektrofotometricky kvantifikována a elektroforeticky testována. DNA byla u rodu Solanum izolována z in vitro kultur, u rodu Malus a Humulus z mladých listů. U háďátek rodu Globodera byly pro izolaci použity jednotlivé cysty.

Markery založené na pricipu PCR

Geny rezistence brambor vůči Ro1 patotypu háďátka bramborového

Pro detekci rezistence byl použit marker pro mitochondriální gen pro podjednotku I enzymu NADH-dehydrogenázy (nad9) - PCR produkt o velikosti 402 bp. Dále byl použit marker genu pro velkou podjednotku enzymu ribulózo-bisfosfát karboxylázy (rbcL) - PCR produkt o velikosti 581 bp. Metodiku aplikace těchto markerů detailně popisuje Leister et al. (1997).

RAPD markery pro taxonomické studie háďátek rodu Globodera

Pro studium variability uvnitř druhů G. rostochiensis a G. pallida byla použita metoda RAPD využívající primery OPA 07, OPG 03, OPG 05, OPG 08, OPG 10, OPG 11 (Operon, USA). Reakce (25m l) obsahovala 10ng templátové DNA, 0,7U Taq polymerázy, 25ng primeru, 2,5mM MgCl2 a 200m M dNTP. Profil amplifikace byl 1 cyklus (94oC, 240s), 40 cyklů (94oC, 30s - 35oC, 45s - 72oC, 90s), 1 cyklus (72oC, 300s). RAPD markery byly separovány agarózovou gelovou elektroforézou a vizualizovány ethidium bromidem.

PCR markery pro detekci Vf genu rezistence jabloní vůči strupovitosti

Pro detekci tohoto genu byl použit optimalizovaný postup současné amplifikace jednoho dominantního a jednoho kodominantního markeru Vf genu. Metodicky tyto analýzy popisuje Tartarini et al. (1998).

RAPD markery odolnoti chmele vůči peronospoře chmelové

Z celkového počtu 210 primerů byly nalezeny 4 primery (OPG 02, OPG 03, OPG 16, OPG 19) vykazující asociaci s odolností nebo senzitivitou chmele k peronospoře. Reakce (25m l) obsahovala 30ng templátové DNA, 0,7U Taq polymerázy, 30ng primeru, 2,5mM MgCl2 a 300m M dNTP. Profil amplifikace byl 1 cyklus (94oC, 240s), 40 cyklů (94oC, 30s - 35oC, 45s - 72oC, 90s), 1 cyklus (72oC, 300s). RAPD markery byly separovány agarózovou gelovou elektroforézou a vizualizovány ethidium bromidem.

Výsledky a diskuse

Geny rezistence brambor vůči Ro1 patotypu háďátka bramborového

U všech genotypů s předpokládanou rezistencí vůči Ro1 patotypu Globodera rostochiensis byly amplifikovány fragmenty s publikovanou délkou. PCR produkt markerující mitochondriální gen pro podjednotku I enzymu NADH-dehydrogenázy (nad9) měl u všech analyzovaných genotypů délku 402 bp. PCR marker genu pro velkou podjednotku enzymu ribulózo-bisfosfát karboxylázy (rbcL) měl vždy délku 581 bp. Tyto závěry se shodují s výsledky, které první publikoval Leister et al. (1997). Na tomto případě je demonstrováno využití PCR markerů pro dva odlišné biochemické mechanizmy rezistence. Rezistentní odrůdy, které byly použity v tomto modelovém experimentu obsahovaly genetickou výbavu pro oba dva typy genetických mechanismů rezistence. Na obrázku 1 je uveden elektroforeogram znázorňující výše popsané markery.

Obrázek 1: Barevně invertovaný elektroforeogram markerů rezistence Solanum tuberosum ssp. tuberosum vůči Ro1 patotypu Globodera rostochiensis

nad 9 rbcI nad 9 rbcI

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 6 6 7 7 6 6 6 7 7 S

Poznámky: Označení genotypů je uvedeno v tabulce 1, S-Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

RAPD markery pro taxonomické studie háďátek rodu Globodera

Pro identifikaci a odlišení druhů a patotypů v rámci rodu Globodera byly v Laboratoři genetických analýz agronomické fakulty vyvinuty metodické postupy vycházející z RAPD amplifikace DNA.

Pomocí RAPD markerů byly vzájemně odlišeny jak druhy tak patotypy. Tímto způsobem popsané populace patotypů rodu Globodera nalézají uplatnění ve skleníkových testech rezistence brambor. Výsledky těchto testů rezistence jsou konfrontovány s výsledky DNA markerování. Výsledky molekulárně genetické taxonomie rodu Globodera jsou srovnatelné s výsledky autorů uvedených v úvodní kapitole tohoto příspěvku. Na obrázku 2 je uveden modelový elektroforeogram RAPD markerů u háďátka bramborového.

Obrázek 2: RAPD marker pro odlišení patotypů G. rostochiensis a G. pallida - primer OPA 07

Ro2 Ro2 Ro5 Ro5 Pa2 Pa2 Pa3 Pa3 S

Získané údaje o polymorfních zónách byly následně statisticky vyhodnoceny programem GelManager for Windows. Získané Diceho podobnostní koeficienty (Jackman, 1994) byly použity pro sestavení dendrogramu, který je znázorněn na obrázku 3.

Obrázek 3: Dendrogram charakterizující genetické vzdálenosti mezi typickými jedinci studovaných populací Globodera rostochiensis a G. pallida

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 [%]

PCR markery pro detekci Vf genu rezistence jabloní vůči strupovitosti

Pro vyhodnocení přítomnosti nebo absence dominatní alely Vf byla použita PCR reakce se dvěma páry specifických primerů. Jeden pár primerů (AM19F-AM19R) umožňoval amplifikaci markeru dominantní alely o velikosti 526 bp. Druhým párem primerů (AL07F-AL07R) byl amplifikován marker dominatní alely (466 bp) a současně byl amplifikován marker recesivní alely (724 bp). Výsledky amplifikace a jejich specificita odpovídají výsledkům, které uvádí Tartarini et al. (1998). Použití této multi-PCR umožňuje při jedné reakci dvojnásobné ověření rezistence. Dominantní marker potvrdí nebo vyloučí rezistenci, kodominantní marker umožní posoudit, zda sledovaný majorgen je dominatně homozygotní, heterozygotní nebo recesivně homozygotní. Možnost jednoznačného určení homo- nebo heterozygotnosti je významné zejména pro šlechtitele, kteří mohou u předem charakterizovaných rodičovských dvojic předpokládat segregaci rezistence v hybridních generacích.

U souboru modelových odrůd jabloní bylo jednoznačně potvrzeno, že rezistentní genotypy jsou heterozygotní a senzitivní genotypy jsou vždy recesivně homozygotní. Elektroforeogram zobrazující výše popsané markery je uveden na obrázku 4.

Obrázek 4: Barevně invertovaný elektroforeogram multi-PCR, primery AL07F-AL07R amplifikují 466bp marker dominantní alely Vf a 724bp marker recesivní alely vf, primery AM19F-AM19R amplifikují 526bp marker dominatní alely Vf genu

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 S

Poznámky: Označení genotypů je uvedeno v tabulce 1, S-Lambda DNA/Eco47I(AvaII)

RAPD markery odolnoti chmele vůči peronospoře chmelové

Pro nalezení potencionálních RAPD markerů byla vytvořena databáze odolných a senzitivních genotypů chmele vůči peronospoře chmelové. Odolnost byla hodnocena dle procentického poškození listové plochy. Databáze genotypů je uvedena v tabulce 3. V této tabulce jsou uvedeny odrůdy našeho i světového sortimentu a novošlechtění. Jediným kritériem pro zařazení do databáze byl extrémní stupeň odolnosti resp. senzitivity k Peronoplasmopara humuli.

Po oveření 210 dekamerických primerů byly vybrány 4 primery, které poskytují potencionální markery odolnosti respektive senzitivity. U každé polymorfní zóny byla hodnocena její relativní četnost v obou extrémních kategoriích genotypů. Jako potencionální markery byly vybrány ty RAPD zóny, které se vyskytovaly v dané genotypové třídě s pravděpodobností větší než 50% a současně bylo u těchto markerů statisticky ověřeno (c 2-test), že poměry mezi výskytem a absencí zóny v I. a V. třídě se shodují s pravděpodobností menší než 1%. U RAPD zón, které se v dané fenotypové třídě vyskytovaly s pravděpodobností 100% nebo 0% nebylo možno c 2-test provést z důvodů jeho matematické definice. V tabulce 4 je uveden přehled nalezených potencionálních markerů. Na obrázcích 5 a 6 jsou uvedeny vzorové elektroforeogramy.

Tabulka 4: Charakteristika markerujících zón pro odolnost k peronospoře chmelové a jejich četnosti v I. a V. třídě genotypů

Obrázek 5:Elektroforeogram RAPD markerů - primer OPG 16 u genotypů zařazených do I. třídy dle odolnosti k peronospoře chmelové, markerující zóna je označena šipkou

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 S

Poznámky: Označení genotypů je uvedeno v tabulce 3, S - hmotnostní standard l DNA/Eco47I(AvaII)

Obrázek 6: Elektroforeogram RAPD markerů - primer OPG 16 u genotypů zařazených do V. třídy dle odolnosti k peronospoře chmelové, markerující zóna je označena šipkou

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 S

Poznámky: Označení genotypů je uvedeno v tabulce 3, S - hmotnostní standard l DNA/Eco47I(AvaII)

Záver

Výsledky experimentů Laboratoře genetických analýz agronomické fakulty ČZU v Praze, které jsou prezentovány v tomto souhrnném příspěvku, je možno shrnout do následujících bodů:

U brambor byly optimalizovány specifické PCR markery pro detekci genů nad9 a rbcL, oba dva geny jsou markerem rezistence bramboru vůči Ro1 patotypu háďátka G. rostochiensis.

U háďátek rodu Globodera byly nalezeny RAPD markery, které umožnily odlišit druhy i patotypy.

U jabloní byl optimalizován postup detekce Vf genu rezistence vůči strupovitosti (Venturia inaequalis CKE.), který využívá současnou amplifikaci dominantního a kodominantního PCR markeru.

U chmele byly navrženy potencionální RAPD markery, které vykazují asociaci s odolností chmele vůči peronospoře chmelové (Peronoplasmopara humuli).

Všechny výše uvedené výsledky jsou součástí komplexních metodických postupů pro využití DNA markerů ve šlechtění rostlin.

Podekování

Rád bych vyjádřil poděkování všem pracovníkům a studentům univerzity, kteří se aktivně podíleli na zajištění výchozího biologického materiálu i na realizaci těchto časově i pracovně náročných experimentů.

Rozsáhlá problematika, která je v tomto příspěvku prezentována, je podporována těmito grantovými projekty: EP9107 - Analýza donorů rezistence k háďátku bramborovému pomocí DNA markerů (NAZV - MZe ČR), EP9229 - Vývoj molekulárních metod diagnostiky karanténních háďátek (NAZV - MZe ČR), EP9357 - Inovace šlechtitelských metod za účelem zkrácení doby tvorby nových hybridních odrůd (NAZV - MZe ČR), EP7254 - Molekulární testace genetické stability genotypů rostlin chmele, kontrola šlechtitelského materiálu a pravosti odrůd chmele (NAZV - MZe ČR), 58/2000 FRVŠ - Využití DNA markerů pro identifikaci patotypů háďátka bramborového (MŠMT ČR), GA AF ČZU 232/10/32899/0 v Praze - DNA markery genů rezistence jabloní (Malus sp.) vůči strupovitosti (Venturia inaequalis CKE.) založené na PCR, MSM 412100002 - výzkumný záměr Stabilizující a omezující faktory tvorby výnosu a jakosti produkce.

Citovaná literatura

Citovaná literatura je uložena u autora příspěvku.