MOLEKULÁRNĚGENETICKÁ DETEKCE R1 GENU REZISTENCE BRAMBORU VŮČI PLÍSNI BRAMBOROVÉ (PHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT.) DE BARY)

Molecular genetics detection of R1 gene provide for resistance of potato against late blight (Phytophthora infestans (Mont.) De Bary)

Petr Sedlák1, Pavel Vejl1, Sylva Skupinová1, Martina Bardová1, Pavel Křenek1, Jaroslava Domkářová2, Lukáš Kreuz1

1 Česká zemědělská univerzita v Praze, Agronomická fakulta

2 Výzkumný ústav bramborářský, s.r.o., Havlíčkův Brod

Souhrn, klíčová slova

V sortimentu deseti odrůd bramboru byla analyzována přítomnost dominantní alely R1 genu rezistence k plísni bramborové. K detekci bylo použito metody CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) založené na restrikčním štěpení monomorfního PCR (Polymerase Chain Reaction) produktu. Jako marker byl použit RFLP marker SPUD237 (De Jong et al., 1997). Produkt amplifikace byl podroben štěpení restrikční endonukleázou AluI čímž byl detekován polymorfismus asociující s přítomností dominantní alely R1 genu. Tato alela byla prokázána u odrůd Bionta, Escort, Fresco, Hertha, Panda, Premiere a Ukama. Odrůdy Karlena, Rosara a Rosella jsou recesivními homozygoty v tomto genu.

Klíčová slova: brambory, rezistence, plíseň bramborová, R1 gen, CAPS markery

Summary, key words

There was analysed a presence of dominant allele of R1 gene in group of different potato varieties. The gene provides for resistance of potato against late blight. CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) method was used to detection. A base of the method is in cleaving of monomorphic PCR (Polymerase Chain Reaction) product. As a marker of R1genewas used RFLP marker SPUD237 (De Jong et al., 1997). The monomorphic product of amplification was cleaved by AluI enzyme. There was detected a polymorphism what corresponded to the presence of dominant allele of R1 gene. The allele was proved in varieties Bionta, Escort, Fresco, Hertha, Panda, Premiere and Ukama. Varieties Karlena, Rosara and Rosella are recessive homozygous in the gene.

Keywords: potato, resistance, late blight, R1 gene, CAPS markers

Úvod

Plíseň bramborovou (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) lze označit za jednu z nejvýznamnějších chorob brambor v celosvětovém měřítku. Choroba napadá listy, lodyhy, hlízy a klíčky. Výskyt choroby má epidemický charakter. Pokud jsou pro patogena během vegetace příznivé klimatické podmínky, může zcela zničit během 10 až 15 dní bramborovou nať a ztráty na výnosu mohou v letech epidemického výskytu dosáhnout 50 % až 70 % (Häni et al., 1988).

Aplikace genetických markerů umožňuje jednoznačně detekovat některé majorgeny determinující rezistenci bramboru vůči této chorobě. CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) patří mezi molekulárně genetické metody založené na digesci amplifikovaných monomorfních PCR (Polymerase Chain Reaction) produktů. Produkty restrikčního štěpení pak vykazují polymorfismus a umožňují detekovat konkrétní alely.

Literární přehled

Rezistence rodu Solanum vůči Phytophthora infestans (Mont.) de Bary je popsána jako monogenní vertikální rezistence nebo polygenně determinovaná horizontální rezistence (Umareus a Umareus, 1994). Horizontální rezistence je ovlivňována velkým množstvím různých faktorů (Black, 1970, Umaerus et al., 1983). Hypersenzitivní rezistence vůči plísni bramborové je řízena dominantními alelami tzv. R genů (Colon, 1994). Bylo již identifikováno jedenáct majorgenů tohoto typu.

Tento příspěvek je zaměřen na markerování hypersenzitivní rezistence řízené majorgeny, a proto jsou další části literárního úvodu věnovány především této problematice. Všechny majorgeny byly nalezeny v genových zdrojích, které odvozují svůj původ od Solanum demissum Lindl. Rezistence byla přenesena do genomu Solanum tuberosum ssp. tuberosum L. pomocí křížení (Wastie, 1991). Rezistentní genotypy reagují na penetraci patogena rychlým odumřením několika buněk na infikovaném místě čímž je zamezeno dalšímu šíření infekce. Tato interakce mezi hostitelem a patogenem je zřejmě typu “gen proti genu” (Colon, 1994). Klonované a sekvenované geny determinující rezistenci rostlin vůči celé řadě patogenů včetně bakterií, hub a virů, vykazují blízkou sekvenční příbuznost (De Jong et al., 1997).

Hlavní nevýhodou monogenně determinované hypersenzitivní rezistence je snadná překonatelnost novými rasami patogena. Odrůdy hypersenzitivně rezistentní pouze vůči jednomu nebo dvěma rasám plísně bramborové, mohou být napadeny a výrazně poškozeny jinými rasami (Domkářová, 2001).

Majorgen R1 byl lokalizován v roce 1992 na chromozómu V (Leonards-Schipers et al., 1992). Nachází se na svrchním ramenu chromozómu v syntenické skupině genů rezistence, která je dále tvořena dominantním genem Nb, determinujícím extrémní rezistenci vůči PVX viru (De Jong et al., 1997). Podle Leonards-Schippers et al. (1992) je dominantní gen R1 vzdálen od RFLP markeru GP21 (Gebhard et al., 1991, Meksem et al., 1995) 2,5cM na jeho centromérní straně. Lokalizace markeru GP179 (Gebrhard et al., 1991, Meksem et al., 1995) byla potvrzena v souvislosti s genovou mapou Solanum tuberosum L. na chromozómu V ve vzdálenosti 3 cM od GP21 (Rouppe van der Voort et al., 1998). Konverze GP21 a GP179 na PCR markery byla popsána Meksem et al. (1995). De Jong et al. (1997) lokalizovalgen R1 mezi markery GP21 a GP179. Stejní autoři při mapování Nb genu objevili pomocí studia segregující generace S1 odrůdy Pentland Ivory metodou AFLP tři markery SPUD237, SPUD839, SPUD128 asociované s dominantní alelou Nb. Studium další generace brambor segregující v R1 genu pomocí CAPS markerů SPUD237 a TG432 prokázalo lokalizaci R1 genu v těsné blízkosti obou jmenovaných markerů na jejich centromérní straně. Markery SPUD237 a TG432 leží na stejném lokusu (De Jong et al., (1997).

Metody

Rostlinný materiál

Byly analyzovány odrůdy brambor s deklarovanou přítomností genu rezistence R1 (Escort, Fresco, Hertha), odrůdy s deklarovanou recesivní alelou r (Rosara, Rosella) a odrůdy s odlišnými alelami genu R nebo s neznámým genotypem (Bionta, Karlena, Panda, Premiere, Ukama). Pro experimenty byly použity in vitro meristemové kultury pěstované na médiu dle Murashige a Skoog (1962).

Izolace DNA

Pro izolaci DNA byla použita modifikace metody Saghai-Maroof et al. (1988) podle Vejl (1998) s extrakčním pufrem obsahujícím CTAB (cetyltrimetylbromid amonný). RNA byla degradována enzymaticky, purifikace byla provedena fenolchloroformovou metodou. Kvantita izolované DNA byla stanovena UV-spektrofotometricky, vysokomolekularita DNA byla ověřena elektroforeticky.

Amplifikace monomorfního PCR produktu a jeho následná digesce

Pro amplifikaci PCR produktu byla použita dvojice primerů podle De Jong et al. (1997) se sekvencí: SPUD237F 5´TTC CTG CTG ATA CTG ACT AGA AAA CC 3´ a SPUD237R 5´AGC CAA GGA AAA GCT AGC ATC CAA G 3´. Vlastní amplifikace probíhala dle následujícího schématu: 40 cyklů (94°C-15s, 60°C-15s, 72°C-60), 1cyklus (72°C-420s). Pro získání polymorfních CAPS markerů digescí monomorfního PCR produktu byla použita restrikční endonukleáza AluI. Digesce probíhala při teplotě 37°C po dobu 3 hodin.

Elektroforetická separace CAPS markerů

Pro fragmentaci produktů restrikčního štěpení byla použita horizontální agarózová elektroforéza s 1,5% gelem v prostředí TBE pufru. Elektroforeogramy byly vizualizovány ethidium bromidem dle Sambrook et al. (1989) a následně digitalizovány.

Výsledky

Dvojice primerů SPUD237R a SPUD237F poskytovala monomorfní PCR produkt o velikosti 400bp. Elektroforeogram tohoto produktu je uveden na obrázku 1.

Na obrázku 2 je uveden výsledek digesce enzymem AluI u všech hodnocených odrůd brambor. Produktem digesce byly fragmenty o velikosti 400bp, 280bp a 170bp.

Obrázek 1: Monomorfní PCR produkt amplifikace markeru SPUD237

S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Poznámky:

1 - Bionta, 2 - Escort, 3 - Fresco, 4 - Hertha, 5 - Karlena, 6 - Panda, 7- Premiere, 8 - Rosara, 9 - Rosella, 10 - Ukama, S1 - hmotnostní standard GeneRulerTM

Obrázek 2: CAPS marker SPUD237 po digesci restrikčním enzymem AluI

S2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S1

Poznámky:

1 - Bionta, 2 - Escort, 3 - Fresco, 4 - Hertha, 5 - Karlena, 6 - Panda, 7- Premiere, 8 - Rosara, 9 - Rosella, 10 - Ukama, S1 - hmotnostní standard GeneRulerTM, S2 - hmotnostní standard l DNA/Eco47I(AvaII). Šipkami jsou označeny senzitivní genotypy, u kterých nedošlo k digesci.

Diskuse

Restrikčním štěpením markeru SPUD237 enzymem AluI byl jednoznačně detekován genetický polymorfismus. Získané výsledky naprosto korespondují se závěry De Jong et al. (1997). U genotypů s deklarovanou dominantní alelou R1 (Escort, Fresco, Hertha) byly získány tři restrikční fragmenty o délce 400 bp, 280 bp a 170 bp. De Jong et al. (1997) ve svých výsledcích uvádí pouze počet fragmentů. Velikost neuvádí zřejmě z toho důvodu, že z hlediska prokazatelnosti přítomnosti R1 alely v genotypu není tento údaj důležitý. U náchylných genotypů nesoucích recesivní alelu r (Rosara, Rosella) k digesci nedocházelo a výsledkem fragmentační analýzy byl původní PCR produkt 400 bp dlouhý. Podobně tomu bylo i u odrůdy Karlena (neznámé založení odolnosti). Pomocí restrikčního štěpení markeru SPUD237 byla s vysokou pravděpodobností detekována dominantní alela R1 u odrůd Bionta, Panda, Premiere a Ukama. U odrůd Bionta a Panda zjištěné výsledky korespondují s vysokým hodnocením odolnosti vůči plísni bramborové v nati. Vokál et al. (2000) hodnotí odolnost vůči plísni bramborové v nati u odrůdy Bionta stupněm 9 a u odrůdy Panda stupněm 7. Naopak odolnost odrůdy Karlena hodnotí stupněm 3, což opět koresponduje s dosaženými výsledky.

Závěr

· Vzhledem k tomu, že marker SPUD237 je od alely R1 vzdálen pouze 0,4 cM, je jen malá pravděpodobnost vzniku rekombinovaných genotypů v tomto markeru.

· Z tohoto důvodu je SPUD237 vhodný k detekci R1 alely genu rezistence k plísni bramborové, což lze s výhodou využít v procesu selekce při tvorbě nových odrůd bramboru.

· Dosažené výsledky obecně prokázaly využitelnost molekulárně genetických markerů pro praktické šlechtění.

Použitá literatura

Black, W.: The nature of inheritance of field resistance to late blight in potatoes. American potato journal, 47, 1970, 279-288.

Colon, L.: Resistance to Phytophthora infestans in Solanum tuberosum and wild Solanum species. Ponsen & Looijen BV, Wageningen, 1994.

De Jong, W. - Forsyth, A. - Leister, D. - Gebhardt C. - Baulcombe, D. C.: A potato hypersensitive resistance gene against potato virus X maps to a resistance gene cluster on chromosome 5. Theoretical and Applied Genetics, 95, 1997, 246-252.

Domkářová, J.: Zhodnocení genofondu odrůd Solanum tuberosum L. z hlediska kvality a odolnosti k chorobám. Doktorská disertační práce, ČZU, Praha, 2001.

Gebhardt, Ch. - Ritter, E. - Barone, A. - Debener, T. - Walkemeier, B. - Schachtschabel, U. - Kaufann, H. - Thompson, R. D. - Bonierbale, M. W. - Ganal, M. V. - Tanksley, S. D., Salamini, F.: RFLP maps of potato and their alignment with homoeologous tomato genome. Theoretical and Applied Genetics, 83, 1991, 49-57.

Häni, F. - Popow, H. - Reinhard, H. - Schvarz, A. - Tanner, K. - Vorlet, M.: Obrazový atlas chorob a škůdců polních plodin. Scientia, s.r.o., pedagogické nakladatelství, Praha 1988.

Leonards-Schippers, C. - Gieffers, W. - Salamini, F. - Gebhardt, Ch.: The R1 gene conferring race-specific resistance to Phytophthora infestans in potato is located on potato chromosome V.. Mol. Gen. Genet., 233, 1992, 278-283.

Meksem, K. - Leister, D. - Peleman, J. - Zabeau, M. - Salamini, F. - Gebhardt, Ch.: A high-resolution map of the vicinity of the R1 locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers. Mol. Gen. Genet., 249, 1995, 74-81.

Murashige, T. - Skoog, T.: A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 1962, 472-497.

Rouppe van der Voort, J. N. A. M. - Lindeman, W. - Folkertsma, R. - Hutten, R. - Overmars, W. - van der Vossen, E. - Jacobsen, E. - Bakker, J.: A QTL for broad - spectrum resistance to cysts nematode species (Globodera sp.) maps to a resistance gene cluster in potato. Theoretical and Applied Genetics 96, 1998, 654 - 661.

Saghai-Maroof, M. A. - Soliman, K. M. - Jorgensen, R.A. - Allard, R.V.: Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, 8014-8019.

Sambrook, J., Maniatis, T., Fritsch, E.F. : Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.

Umaerus, V. - Umaerus, M. - Erjes L. - Nilsson, B. A.: Control of Phytophthora by hosts resistance: Problems and Progress. In: Ervin, D. C. - Bartnicky - Garcia, S. - Tsao, P. H. (ed.) Phytophthora, its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology St Paul, Minnesota: American Phythopathological Society, APS Press, 1983, 315-326.

Umaerus, V. - Umaerus, M.: Inheritance of resistance to pests and diseases, Late blight. In : Bradshaw, J. E. - Mackay, G. R. (ed.) Potato Genetics Cambridge: CAB International, University Press, 1994, 365 - 401.

Vejl, P.: Využití genetických markerů pro tvorbu dihaploidů pšenice obecné (Triticum aestivum L.). Doktorská disertační práce, ČZU, Praha, 1998.

Vokál, B. - Cvrček, M. - Čepl, J. - Čížek, M. - Domkářová, J. Fér, J. - Hauswater, E. - Králíček, J. - Prugar, J. - Rasocha, V. - Zrůst, J.: Brambory, Agrospoj Praha, 2000.

Wastie, R. L.: Breeding for resistance. In: Ingram, D. S. - Williams, P. H. ed. Advances in Plant Pathology Phytophthora infestans, the cause of late blight of potato. Academics Press, 1991, 193-224.

Kontaktní adresa

Ing. Petr Sedlák,

Česká zemědělská univerzita v Praze, AF, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 - Suchdol,

Tel.: 02/24382560, e - mail: sedlak@af.czu.cz

Autorský kolektiv by rád na tomto místě poděkoval všem pracovníkům České zemědělské univerzity v Praze a Výzkumného ústavu bramborářského v Havlíčkově Brodě, kteří se podíleli na získání prezentovaných výsledků.

Tato práce byla podporována grantovým projektem Fondu rozvoje vysokých škol - Agentury rady vysokých škol “G4-1341/2001 Markery genů rezistence bramboru vůči plísni bramborové založené na PCR” a “Výzkumným záměrem AF ČZU v Praze MSM-412100002”.