Odlišení odrůd bramboru Solanum tuberosum ssp. tuberosum RAPD metodou

Odlišení odrůd bramboru Solanum tuberosum ssp. tuberosum RAPD metodou

Distinguishing of potato varieties (Solanum tuberosum ssp. tuberosum) by RAPD method

Petr Sedlák, Sylva Skupinová, Pavel Vejl, Martina Bardová

Česká zemědělská univerzita v Praze

Abstract

Present trends in collecting of gene pool of potato need new methods to distinguishing of different varieties. For the reason was method for fast end non-destructive distinguishing of potato varieties made. Seventeen of potato varieties were distinguished by RAPD method. There were used five dekameric primers of Operon G set. These primers were OPG 02, OPG 03, OPG 06, OPG 12 and OPG 16. Primers offered sufficient number of polymorphic bands, that were evaluated by bulked analyse by Dices coefficients of similarity individual electrophoreograms. Analyses have shown significant differences between individual genotypes. Applicability of this method is limited because of lower reproducibility of RAPD. The method is fit to distinguishing of varieties if the standard conditions are observed.

Potato, distinguishing of varieties, DNA, primers, RAPD

Souhrn

Vzhledem k stávajícím technikám uchovávání genových zdrojů bramboru byla vypracována metodika k rychlému a nedestruktivnímu odlišení genotypů bramboru. Sedmnáct odrůd bramboru (Solanum tuberosum ssp. tuberosum L.) bylo odlišeno metodou RADP pomocí pěti dekamerických primerů kitu Operon G. Jednalo se o primery OPG 02, OPG 03, OPG 06, OPG 12 a OPG 16. Tyto primery poskytly dostatečné množství opakovatelných polymorfních zón, které byly vyhodnoceny shlukovou analýzou na základě Diceho podobnostních koeficientů. Shluková analýza prokázala významné rozdíl mezi jednotlivými genotypy. Použitelnost metody je limitována nižší opakovatelností RAPD. Při dodržení podmínek je metoda vhodná pro odlišení odrůd.

Úvod

Brambor hlíznatý (Solanum tuberosum ssp. tuberosum L.) patří v celosvětovém měřítku mezi významné hlíznaté okopaniny. V současnosti je v naší republice registrováno 114 odrůd typu klon, z nichž je většina zahraniční provenience (Seznam odrůd zapsaných ve Státní odrůdové knize České republiky,2002).

Brambor byl do Evropy dovezen v 16. století z jižní Ameriky původně jako okrasná rostlina, později jako potrava chudých. Počátek cíleného šlechtění bramboru se datuje od poloviny století devatenáctého, kdy po sobě jdoucí epidemie plísně bramborové (Phytophthora infestans (Mont.) de Bary) zdecimovaly porosty bramboru s následkem těžkého hladomoru, zejména v Irsku. Výchozí genetická variabilita je rozšiřována křížením v rámci druhu i mezi druhy. V současné době je u bramboru velice aktuální využívání různých technik genového inženýrství. Vzhledem k vysoké heterozygotnosti rodičovských komponent dochází v F1 generaci ke štěpení. V této generaci je zahájen výběrový systém zvaný klonová selekce (Chloupek, 2000). Standardní a dosud běžně používaný popis odrůd vychází z charakteristiky morfologických a anatomických vlastností nadzemních i podzemních částí rostliny.

Literární přehled

Snahy o odrůdový fingerprinting jsou zapříčiněny neustále se zvyšujícím počtem odrůd, které lze mnohdy obtížně rozeznat pomocí morfologických znaků. Dalším z faktorů, který vede genetická pracoviště k metodám přímé genetické identifikace, je skutečnost, že genové zdroje bramboru jsou mnohdy uchovávány vin vitro nebo v kryokonzervovaných kulturách. Stanovení odrůdové pravosti u in vitro materiálů na základě morfologického popisu rostlin je zcela nemožné.

První biochemickogenetické markery, které směřovaly k odrůdovému "fingerprintingu", byly založeny na elektroforetické separaci zásobních proteinů hlíz Desborough a Peloquin (1968). Bylo však zjištěno, že složení zásobních proteinů hlíz bramboru je mnohem více modifikovatelné vlivy vnějšího prostředí, než zásobní proteiny obilek. Další typ biochemickogenetických markerů založených na polymorfismu tentokrát izoenzymových systémů u brambor aplikovali Stegemann a Schnick (1985). Závislost variability izoenzymových systémů na růstové fázi analyzované rostliny a na typu rostlinného materiálu, ze kterého byly izoenzymy získány, potvrdili Desborough a Peloquin (1968). Tento fakt silně znevýhodňuje použití těchto markerů. Vpozdějších letech byly pro identifikaci odrůd využívány první molekulárně genetické metody. Např. Gorg et al. (1992) použil pro rozlišení odrůd brambor metodu RFLP. Zcelkového počtu 136 odrůd se mu zdařilo vzájemně odlišit 130 genotypů pomocí jedné kombinace sonda - restrikční enzym.

Při odlišení odrůd brambor je velice často používána metoda RAPD (Random amplified polymorphic DNA) založená na amplifikaci odrůdově specifických fragmentů DNA. Hosaka et al. (1994) použil 31 RAPD markerů pro vzájemné odlišení 67 odrůd zcelkového počtu 73 genotypů. Sosinski a Douches (1996) hodnotili vhodnost 16 RAPD primerů a vybrali 10 primerů, které poskytly specifické produkty pro 46 severoamerických odrůd bramboru. Demeke et al. (1993) rovněž dospěl knázoru, že RAPD "fingerprinting" je ve srovnání spostupem RFLP výrazně rychlejší a levnější. Vejl (1997) uvádí identifikaci a vzájemné odlišení odrůd brambor rovněž s využitím RAPD markerů. Specifické RAPD zóny získal při amplifikaci soktamerickým primerem.

Metodika

Biologický materiál

Biologický materiál byl získán z genové banky bramboru při Výzkumném ústavu bramborářském v Havlíčkově Brodě. Jednalo se o in vitro rostlinky odrůd Amylex (a), Berber (b), Calla (c), Evita (d), Gloria (e), Karin (f), Kobra (g), Korneta (h), Lada (i), Lomnica (j), Mondial (k), Ostara (l), Rubín (m), Solara (n), Tegal (o), Vera (p) a Zlata (q). Odrůdy jsou označeny písmeny pro snadnější orientaci v následujících obrázcích.

Izolace DNA

DNA byla izolována metodou podle Saghai-Maroof et al. (1984) modifikovanou podle Vejl (1998) ze 100g zelené hmoty rostlin.

Amplifikace DNA

DNA byla amplifikována v termocykleru T-gradient (Biometra, SRN). Pro získání polymorfních zón bylo použito těchto 5 oligonukleotidových sekvencí z kitu firmy Operon OPG 02 5-GGC ACT GAG G -3, OPG 03 5-GAG CCC TCC A-3, OPG 06 5-GTG CCT AAC C-3, OPG 12 5-CAG CTC ACG A-3 a OPG 16 5-AGC GTC CTC C-3.

Složení 25l reakce bylo následující: 10ng templátové DNA, 1x PCR pufr, 2,5 mM MgCl2, 200M dNTP, 25ng primer a 0,7U Taq polymeráza (Sigma, SRN). Časově teplotní profil RAPD reakce byl nastaven takto: 1x (94 C, 260 s), 40x (94 C 30 s, 36,5 C 45 s, 72C 90s) a 1x (72C 300s).

Elektroforetická separace RAPD produktů a počítačová analýza elektroforeogramů

Produkty RAPD reakce byly separovány v horizontálním, 1,5% agarózovém gelu. K separaci bylo použito zařízení firmy BioRad (USA). Elektroforeogramy byly vizualizovány podle standardní metodiky ethidium bromidem a pod UV světlem dokumentovány pomocí kamery Polaroid. Elektroforeogramy byly následně digitalizovány na stolním skeneru a vyhodnoceny pomocí programu GelManager for Windows. Podobnost jednotlivých drah byla hodnocena na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti "bandu" v každé zóně odpovídající amplifikovanému fragmentu DNA pomocí Diceho podobnostních koeficientů. Byly porovnány všechny získané elektroforeogramy a vypracována shluková analýza, jejímž výsledkem je přiložený dendrogram a podobnostní matice Diceho koeficientů.

Výsledky a diskuse

Z celkového počtu 75 primerů bylo vybráno 5 dekamerických primerů, které umožnily vzájemně odlišit všechny uvedené odrůdy. Pro odlišení byly vybrány primery sady Operon (USA). Primer OPG 12 použil ve svých RAPD analýzách také Demeke et al. (1993). Pro hodnocení genetické vzdálenosti byly použity pouze ty RAPD produkty, které se vyznačovaly reprodukovatelností amplifikace a současně byly schopny postihnout variabilitu mezi porovnávanými odrůdami bramboru.

Obrázek 1: Elektroforeogram RAPD produktů primer OPG 02 u odrůd brambor

a b c d e f g h i j k l m n o p q S

Poznámky:

S - hmotnostní standard DNA/Eco47I (AvaII)

Označení genotypů je uvedeno v tabulce 25, sekvence primeru v tabulce 26.

Pro zadávání vstupních údajů pro program GelManager for Windows byly použity pouze odrůdově specifické polymorfní zóny. RAPD zóny, které nevykazovaly mezi odrůdami polymorfismus, nebyly pro hodnocení použity. Toto kritérium platilo rovněž i pro zóny, které byly slabě amplifikovány a nedaly se reprodukovatelně identifikovat.

V následující tabulce jsou uvedeny hodnoty Diceho podobnostních koeficientů, které byly získány vyhodnocením všech polymorfních zón. Hodnoty Diceho podobnostních koeficientů byly použity pro sestavení dendrogramu uvedeného na obrázku 2.

Tabulka: Matice Diceho podobnostních koeficientů vyjadřujících podobnosti [%] mezi RAPD profily u analyzovaných odrůd brambor (písmena označují genotypy, viz text)

Obrázek 2:Dendrogram sestavený na základě všech polymorfních RAPD zón vyjadřující genetické vzdálenosti u odrůd brambor

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%

Důležitým faktorem pro specifičnost amplifikace je volba "annelační" teploty a časových parametrů RAPD amplifikace. V obecné části práce byl uveden vztah mezi specifičností amplifikace a hodnotou "annelační" teploty. Obecně vyšší teplota zaručuje vyšší specifičnost hybridizace mezi primerem a templátovou DNA a tím snižuje frekvenci nespecifických amplifikací. Waugh et al. (1992) uvádí "annelační" teplotu 35°C, Singsit a Ozias-Akins (1993) 36°C a Mandolino et al. (1996) 38°C. Z výše uvedeného přehledu plyne, že "annelační" teplota se u RAPD odrůdového "fingerprintingu" pohybovala mezi 35-38°C. Pro získaní výsledků uvedených v této kapitole práce byla použita teplota 36,5°C, což odpovídá intervalu teplot, které použili citovaní autoři.

Pro statistické vyjádření meziodrůdové variability byla provedena shluková analýza vycházející z Diceho podobnostních koeficientů. Statistické vyjádření variability RAPD markerů provedli také Singsit a Ozias-Akins (1993). Variabilitu mezi porovnávanými genotypy nehodnotili graficky formou dendrogramu, ale pouze hodnotami podobnostních koeficientů. Demeke et al. (1993) hodnotil markerovací schopnost RAPD zón jejich relativní četností výskytu u jednotlivých genotypů.

Závěr

Na základě dosažených výsledků lze říci, že zvolený metodický postup a vybrané oligonukleotidy umožnily spolehlivě odlišit sedmnáct uvedených odrůd. V průběhu experimentů se potvrdilo, že je nutno dodržovat konstantní podmínky pro dosažení opakovatelných RAPD profilů vhodných pro spolehlivé odlišení genotypů. Pro případné použití metody lze jenom doporučit optimalizaci podmínek metody pro konkrétní laboratorní podmínky.

Literatura

Přehled citované literatury je k dispozici u autora.

Kontaktní adresa autora:

Ing. Petr Sedlák,

KGOZ AF ČZU vPraze, Kamýcká 957, Praha 6, Suchdol.

e-mail: sedlak@af.czu.cz

Práce je podporována výzkumným záměrem MSM 412100002 a grantovým projektem GA ČZU 21160/1312/213143.