Pokus o detekci apoptózy v melanomu prasete během jeho regrese

A search for apoptosis in pig melanoma during its regression

Pokus o detekci apoptózy v melanomu prasete během jeho regrese

Reisnerová H., Rytina L., Hruban V., Horák V.

KVD AF ČZU, Institute of animal physiology and genetics, Czech Academy of Sciences

Souhrn, klíčová slova

Experimenty s ischemizací (devitalizací) primárních prasečích nádorů vedly k regresi nádorů i metastáz( Horák, V. et al., 1999). Byly ověřeny tři metody detekce apoptózy: a) TUNEL b) Apostain and c) DNA ladder metoda

apoptóza, prasečí model, devitalizace, metody

Summary, keywords

Previous experiments with surgical ischaemization (devitalization) of swine primary melanoma tumours located on skin surface revealed immediate regression of all intact visceral metastases (Horák, V. et al.,1999). We used three technigues: a)TUNEL b) Apostain and c) DNA ladder metoda

apoptosa, swine model, devitalization, methods

Introduction - Úvod

U laboratorních prasat chovaných v Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AVČR se před několika lety objevil pigmentový zhoubný nádor-maligní melanom (melanoblastom). Selektivním pářením nositelů nádoru, kteří byli vyléčeni se podařilo stabilizovat linii prasat s dědičným výskytem tohoto tumoru. Kvůli jednoduché dědičnosti a možnosti vyléčení melanomu se tento kmen ukázal jako cenný experimentální model s mnoha analogiemi s lidskou formou tohoto nádoru.

Methods - Metody

1. Morfologická analýza

2. Analýza DNA

3. Analýza změn na cytoplasmatické membráně

4. Analýza substrátů smrti

5. TUNEL metoda

6. APOSTAIN metoda

7. DNA ladder metoda

Metody 5,6,7 byly použity při detekci apoptózy v prasečích melanomech po devitalizačním zákroku.

Results - discussion - Výsledky - diskuse

Detekce buněčné smrti apostatinem nepřinesla žádný pozitivní výsledek, proto můžeme provést porovnání pouze u dvou technik: DNA žebříčku a metody ”TUNEL”.

Výsledky DNA fragmentace dokazují, že devitalizační zákrok navozuje v ošetřené tkáni především nekrotické, ale i apoptotické změny. Zásadním zjištěním, bez ohledu na to o jaký proces se jedná, je skutečnost, že ke změnám v nádorových buňkách detekovaných použitými technikami dochází velmi rychle po devitalizaci-řádově po několika hodinách.

Důležité pro další výzkum je, že byly zavedeny 2 metody detekce buněčné smrti, kterými bude možné sledovat dynamiku regrese navozené devitalizační technikou, a to nejen v devitalizovaném nádoru, ale i v sekundárních kožních tumorech a metastázách.

Pro podporu hypotézy o aktivaci protinádorové imunity bylo v poslední době nalezeno několik přímých důkazů.

Po devitalizačním zákroku dochází k indukci exprese heat-shock proteinů HSP70 a gp 96, které jsou schopny aktivovat buněčnou imunitu přes antigen prezentující buňky (APC), např. dendritické buňky. Dále bylo prokázáno, že po devitalizačním zákroku se v nádorech výrazně zvyšuje množství cytotoxických T-lymfocytů, které mohou být zodpovědné za generalizovanou destrukci melanomových buněk.

Hypotéza: Záhy po devitalizaci primárního tumoru se do okolní tkáně uvolní heat-shock proteiny atrahující APC. Ty jsou schopny na svém povrchu prezentovat nádorově specifické proteiny z rozpadajících se nádorových buněk. Takto vyzrálé APC putují do regionálních lymfatických uzlin, kde vyškolí T-lymfocyty proti epitopům nádorových proteinů. Diferencované cytotoxické T-lymfocyty(CTL) pak putují organismem a jsou schopny likvidovat nádorové buňky ve všech ložiscích (neošetřených primárních nádorech i metastázách).

Mechanismus likvidace nádorových buněk by mohl být uskutečněn cestou navození apoptózy u těchto buněk. Je známo, že CTL uvolňují granzym B, který za pomoci perforinu proniká do nitra buňky a je schopen aktivovat caspázovou kaskádu. Další známá cesta navození apoptózy u cílových buněk je přes Fas ligand(CD 95 ligand). T-lymfocyt rozpozná prostřednictvím svého receptoru nádorovou buňku, naváže se na ni a exprimuje CD 95 ligand, který vyvolá přes příslušný CD95 receptor nádorové buňky její apoptózu.

Výzkumná práce měla za úkol stanovit pomocí metod pro detekci apoptózy zda a kdy dochází u prasat po devitalizačním zákroku v takto ošetřených nádorech k apoptóze. Pro detekci byly použity 3 nezávislé postupy.

Na tkáňové řezy z maligních melanomů byla aplikována:

· Souprava reagencií firmy Boehringer Mannheim/Roche-In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein(”TUNEL”-technika)

· Monoklonální protilátka proti jednořetězové DNA Mab F7-26 s komerčním názvem Apostain (firma MedSystems Diagnostics).

· Pro stanovení DNA fragmentace (pro apoptózu typický DNA ”žebříček” fragmentů) byla z nádorové tkáně (metodou fenol-chloroform-isoamylalkohol)vyizolována DNA a vizualizována pomocí gelové agarózové elektroforézy.

Metoda detekce apoptózy protilátkou Apostain nedává na tkáňový řezech výsledky. Metodou ”TUNEL” a analýzou DNA fragmentace jsme zjistili, že v devitalizovaném nádoru i nádorech neošetřených touto technikou dochází velice záhy po zákroku k buněčné smrti. Důležitým výsledkem experimentální práce je zavedení dvou nezávislých metod pro detekci buněčné smrti a zjištění dynamiky působení zákroku na tkáň. První detekovatelné zvýšení počtu umírajících buněk v tumoru nastává již po 4 hodinách od devitalizace a procento pozitivně reagujících buněk dál rapidně vzrůstá, po třech dnech od první operace je v tumoru až 64% apoptózou či nekrózou zanikajících buněk.

References - Použitá literatura

Horák,V., Fortýn, K., Hruban, V., Klaudy J.: Cell Mol. Biol., 45: 1119,1988