Uplatnění bílkovinných markerů u osiva pšenice a ječmene a sadby brambor

Uplatnění bílkovinných markerů u osiva pšenice a ječmene a sadby brambor

Utilization of protein markers at wheat and barley seed stock and potato planting

Jana Bradová, Světlana Sýkorová, Antonín Šašek

Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha Ruzyně

Abstract

Cultivars of all important crops are bearers of their qualitative properties (nutritive, technological, hygienic etc.). The methods which can characterize cultivar identity, purity and trueness are very important for the quality of agricultural products and foods. The composition of storage proteins of cereal grain (prolamins, glutelins) and potato tuber protein is conditioned and fixed genetically by specific loci and by this way the genotyp can be characterized. In addition the signal genes of storage proteins are linked in some cases with the genes of economically important properties and may also be the indirect markers of these traits. These facts are used mainly at wheat and barley. Using this criterion the variety can be characterized with high reliability. The gel electrophoresis of the mentioned proteins (SGE, PAGE, SDS-PAGE) is very suitable method for this purpose. New 5 wheat and 8 barley varieties were added to the catalogue of protein genetic markers (gliadins, WMH glutenins, hordeins). The catalogue of 59 registered potato varieties was constructed.

wheat, barley, potatoes, varieties, gliadins, HMW-glutenins, hordeins, tuber proteins, electrophoresis, genotype characterization

Souhrn

Odrůdy všech důležitých plodin jsou nositeli jejich kvalitativních vlastností (nutričních, technologických, hygienických, atd.). Metody, kterými je možné charakterizovat odrůdu, její čistotu a pravost jsou velmi důležité pro kvalitu zemědělských produktů a potravin. Složení zásobních proteinů v zrnech obilnin (prolaminy, gluteliny) a proteinů v hlízách brambor je určeno a vázáno geneticky specifickými lokusy a je tak možno s jejich pomocí charakterizovat konkrétní genotyp. Signální geny zásobních proteinů jsou spojeny v některých případech s geny ekonomicky důležitých vlastností a mohou sloužit jako jejich nepřímé markery. To je využíváno zejména u pšenice a ječmenů. Využitím těchto markerů je možné jednotlivé odrůdy charakterizovat s vysokou spolehlivostí. Pro tento účel je velice vhodnou metodou gelová elektroforéza těchto proteinů (SGE, PAGE, SDS-PAGE). Do katalogu proteinových genetických markerů (gliadiny, WMH gluteniny, hordeiny) bylo přidáno 5 nových odrůd pšenice a 8 odrůd ječmene. Také byl vytvořen katalog 59 registrovaných odrůd brambor.

Úvod

U všech důležitých kulturních zemědělských plodin je odrůda (kultivar) jedním z nositelů kvalitativních vlastností, jak z hlediska nutriční, tak i technologické a hygienické jakosti. Pro kvalitu zemědělských produktů a potravin proto mají význam všechny metody, jimiž je možno charakterizovat identitu, původnost, čistotu a pravost odrůdy. Většina důležitých rostlinných druhů zahrnuje velký počet (často blízce příbuzných) odrůd. Možnost jejich identifikace a rozlišení má bezesporu značný ekonomický význam. Pro účely rozlišení odrůd mnohých komerčně významných plodin (obilniny, kukuřice, brambory, pícniny, luskoviny) jsou používány morfologické znaky, jejichž projevy jsou značně závislé na vnějších podmínkách (ročník, lokalita, výživa, atd.). Proto byly hledány další způsoby identifikace odrůd, což je např. využití různých bílkovinných systémů uplatňujících se jako genetické markery, které umožňují charakterizovat genotyp na základě geneticky definovaného polymorfismu jednotlivých bílkovinných složek, prakticky nezávislých na vnějších faktorech.

Gliadiny a podjednotky gluteninů s VMH (vysokými molekulárními hmotnostmi) u pšenice, resp. hordeiny u ječmene představují genetické markery, umožňující rychlou a objektivní biochemickou či genetickou identifikaci odrůd pšenice a ječmene, stanovení jejich genetické struktury, případně markerování některých významných hospodářských znaků a vlastností. Předpokladem účelného využívání registrovaných odrůd pšenice a ječmene ve šlechtění, semenářství, semenářské kontrole a zejména při stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty dávek merkantilní pšenice a ječmene pro potřeby obchodu a zpracovatelského průmyslu je používání vzorových elektroforetických spekter gliadinů, příp. VMH podjednotek gluteninů, resp. hordeinů. Katalogy elektroforetických spekter gliadinů, VMH podjednotek gluteninů pšenice, resp. hordeinů a esteráz ječmene všech registrovaných odrůd jsou v ČR o roku 1984 publikovány (Šašek at al., 2000) a každoročně doplňovány o nově registrované odrůdy.

U brambor je odrůda nositelem kvalitativních vlastností jako jsou např. barva, vůně, chuť, vařivost dužniny, ale i jednotlivé charakteristiky odolnosti kchorobám a škůdcům. Za vhodné pro identifikaci odrůdy jsou pokládány stabilní znaky hlíz, znichž byly již v 60. a 70. letech vUSA i v Evropě (např. v SRN) úspěšně využity jako genetické markery rozpustné proteiny a enzymy hlíz, případně jejich kombinace. Hlízy brambor představují relativně homogenní pletivo, z něhož lze extrahovat rozpustné proteiny, představované hlavně albuminy (60%) a globuliny (20%). Účinnou metodou pro využití genetických markerů je metoda elektroforézy. Důležité je, že získané elektroforetické spektrum hlízových proteinů je odrůdově specifické, nemění se i v hlízách skladovaných po několik měsíců v chladu, pěstovaných na různých lokalitách, v různých ročnících, jakož i v různých pěstebních systémech (konvenčně nebo na biofarmách). Metoda je navíc dostatečně expeditivní a poskytuje výsledky do 48 hodin, zatímco biologické testy jsou časově podstatně náročnější.

Materiál a metody

K elektroforetickým analýzám gliadinů a VMH podjednotek gluteninů, resp. hordeinů byly použity standardní (etalonové) vzorky semen odrůd jarních a ozimých forem pšenice a ječmene registrovaných v roce 2002, poskytnuté Odborem odrůdového zkušebnictví ÚKZÚZ. Jedná se o odrůdy pšenice Bill, Clever, Mladka, Rheia, Trend a Corso (rok povolení 2001) a odrůdy ječmene Lomerit, Merlot, Reni, Diplom, Malz, Philadelphia, Prestige, Saloon.

Elektroforetická skladba gliadinů a hordeinů byla hodnocena u 50 zrn metodou vertikální elektroforézy ve sloupcích škrobového gelu v Al-laktátovém pufru při pH 3,1 se 2 mol.l-1 močoviny (ČSN 46 1085-1). Elektroforetická skladba VMH podjednotek gluteninů byla zjišťována hodnocením 10 náhodně odebraných zrn modifikovaným postupem vertikální diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného (Laemmli, 1970).

Elektroforetické analýzy hlízových proteinů byly dosud provedeny u 59 registrovaných odrůd brambor z etalonových vzorků hlíz poskytnutých Zkušební stanicí Lípa u Havl. Brodu OOZ ÚKZÚZ. Byla použita referenční metoda elektroforézy hlízových proteinů podle německého Bundessortenamt (PAGE v Tris borátovém pufru), (Methode Bundessortenamt, 1993). Z každého etalonového vzorku bylo analyzováno 5 jednotlivých hlíz. Byl zpracován katalog číselných hodnot relativních elektroforetických mobilit (REM) jednotlivých pruhů a grafické vyjádření elektroforetického spektra pro každou z odrůd.

Výsledky a diskuse

Polymorfismus a identifikace odrůd pšenice a ječmene

Výsledky elektroforetických analýz gliadinů získaných škrobovou elektroforézou (SGE) a VMH podjednotek gluteninů hodnocených odrůd pšenice obecné jsou představeny v tabulce 1 v podobě souborů alelických bloků, vyčleněných z elektroforetických spekter použitých bílkovinných markerů jednotlivých odrůd. Soubory vyčleněných alelických hordeinových bloků zón jarních a ozimých odrůd ječmene získané (SGE) jsou uvedeny v tabulce 2.

Z celkového počtu 6 nově registrovaných odrůd pšenice ozimého a jarního typu je pouze odrůda Trend gliadinově homogenní v elektroforetické skladbě gliadinů a VMH podjednotek gluteninů. Tuto odrůdu podle použitých bílkovinných markerů lze považovat za odrůdu typu čisté linie. Gliadinový polymorfismus byl zjištěn u odrůd Bill, Mladka, Clever, Rheia a Corso, když Bill, Mladka a Corso jsou dvouliniové a Clever a Rheia jednoliniové s přítomností statisticky neprůkazných sublinií (označených písmenem v závorce). Polymorfismus ve skladbě VMH podjednotek gluteninů zjištěn nebyl, odrůdy byly gluteninově homogenní, jednoliniové.

Tab. 1: Gliadinové a gluteninové genetické markery odrůd pšenice obecné nově registrovaných v ČR v roce 2002

Vysvětlivky:

PJ - pekařská jakost odrůd pšenice: E elitní, A kvalitní, B chlebová, C nevhodná

Ze sledovaného souboru 8 odrůd ječmene jak jarního, tak ozimého se 5 odrůd (Malz, Prestige, Lomerit, Merlot, Reni) vyznačuje jedinečnými, pro odrůdu specifickými elektroforetickými spektry. Těchto 5 odrůd lze tedy spolehlivě identifikovat a vzájemně rozlišit elektroforézou hordeinů. Shodná hordeinová elektroforetická spektra byla zjištěna u odrůd Diplom, Philadelphia a Saloon, nelze je proto jednoznačně hordeinově odlišit a je nutno k rozlišení těchto odrůd použít dalšího bílkovinného systému např. esteráz. (Bradová at al., 2001).

Tab. 2: Hordeinové genetické markery odrůd ječmene nově registrovaných v ČR v roce 2002

USJ ukazatel sladařské jakosti

9 nejvyšší; 1-nejnižší; N-nesladovnická; - nestanoven

Identifikace a rozlišení odrůd brambor

Soubor dosud analyzovaných etalonových vzorků 59 registrovaných odrůd brambor je uveden v tabulce 3.

Tab. 3: Přehled dosud analyzovaných registrovaných odrůd brambor

Na obrázku 1 jsou uvedeny příklady grafického znázornění elektroforetických spekter hlízových proteinů z vypracovaného katalogu odrůd. Na tomto modelovém souboru bylo prokázáno, že odrůdy lze tímto postupem vzájemně odlišit.

Závěr

Uvedené metody elektroforézy zásobních bílkovin pšenice a ječmene a hlízových proteinů brambor představují rychlý a objektivní nástroj pro stanovení pravosti, čistoty a genetické struktury odrůd. Tyto údaje jsou velmi důležitou informací pro šlechtění a semenářskou kontrolu jakosti, jakož i pro další oblasti ( např. obchod, ochrana spotřebitele) a lze je získat v ČR u některých firem za úhradu.

Obr. 1: Příklady elektroforetických spekter hlízových proteinů odrůd brambor

Literatura

Bradová, J., Sýkorová, S., Šašek, A., Černý, J. Identification of common barley varieties by parallel electrophoresis of hordeins and esterase.Rostl.výroba, 47, 2001(4):167-173.

Český normalizační institut: ČSN 46 1085-1. Pšenice obecná a ječmen - Stanovení odrůdové pravosti a odrůdové čistoty - Část 1: Elektroforéza bílkovin ve škrobovém gelu(SGE) ČNI Praha, červenec 1998

Laemmli, V. K. Cleavage of structural protein during assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 227, 1970:680-685.

Šašek, A., Černý, J., Sýkorová, S., Bradová, J. Inovované katalogy bílkovinných genetických markerů pšenice seté a ječmene. ÚZPI Praha,2000

Proteinpolymorphismen bei der Kartoffel. Beschreibung der Elektrophorese - Methode Bundessortenamt, Referat Z5, Hannover, den 3.11.1993, L RP/Elpho II/4.

Tento expertní projekt E-02-3020-0011 byl financován MZe ČR.

Kontaktní adresa autora:

Ing. Jana Bradová

VÚRV Praha Ruzyně, Drnovská 507, 16106 Praha 6

e-mail: bradova@vurv.cz