ZMĚNY OBSAHU POLYFENOLICKÝCH LÁTEK JEČMENE A HRACHU PŮSOBENÍM UV A GAMA ZÁŘENÍM

Changes of polyphenol content in barley and pea caused by UV and gamma irradiation

Matyáš Orsák1, Jaromír Lachman1, Vladimír Pivec1,

Václav Hosnedl2

1Katedra chemie a 2Katedra rostlinné výroby,

Agronomická fakulta, Česká zemědělská univerzita v Praze

Souhrn, klíčová slova

Ve dvou odrůdách ječmene (Krona, Kompact) a hrachu (Lantra, Menhir) byly sledovány změny celkového obsahu polyfenolických látek (CP) a dominantně zastoupených fenolických kyselin způsobených UV-A a g -zářením. Změny byly sledovány v semenech, naklíčených semenech a rostlinách. V odrůdách ječmene byl také sledován obsah látek typu resorcinolu, floroglucinolu a katecholu (RFK). Obsah celkových polyfenolů (CP) byl stanoven spektrofotometricky s Folin-Ciocalteuovým činidlem, obsah polyfenolických látek typu resorcinolu, floroglucinolu a katecholu (RFK) spektrofotometricky s p-dimethylamino-skořicovým aldehydem a fenolické kyseliny pomocí HPLC. UV záření bylo aplikováno po 0, 24, 48 a 72 hod. při vlnové délce l =351 nm, g -záření s 60Co v dávkách 0, 10, 20 a 40 Gy. Během klíčení hrachu došlo ke zvýšení obsahu CP, u odrůd ječmene byla zjištěna stagnace. UV-A záření způsobilo u sledovaných rostlin nárůst obsahu celkových polyfenolů, g -záření zvýšilo obsah CP u ječmene, avšak u hrachu docházelo k jeho snížení. Byla prokázána statistická závislost obsahu celkových polyfenolů na růstových fázích rostliny a na dávkách záření. Různé odrůdy reagovaly na ozáření různými změnami obsahu celkových polyfenolů i látek typu RFK. UV-A a g -záření snižovala obsah látek typu resorcinolu, floroglucinolu a katecholu u ječmene. Statisticky významná závislost byla nalezena mezi obsahem RFK a dávkami záření a vegetační fází rostlin. Obsah RFK v naklíčených semenech se snižoval, avšak v dalším vývoji rostlin docházelo k jeho nárůstu. Nejvíce zastoupené fenolické kyseliny u hrachu a ječmene byly 2,3-dihydroxybenzoová, sinapová, m-hydroxybenzoová, veratrová a vanillová kyselina. UV-A záření způsobilo zřetelný nárůst obsahu těchto kyselin jak u ječmene, tak i uhrachu, zatímco g -záření způsobilo pouze malé změny v obsahu těchto látek.

Klíčová slova: UV-A záření; gamma záření; ječmen; hrách; polyfenoly; fenolkarboxylové kyseliny; resorcinol, floroglucinol a katechol

Summary, key words

In two barley cultivars (Krona, Kompact) and pea cultivars (Lantra, Menhir) changes in total polyphenol content (CP) and major phenolic acids caused by UV-A and g - irradiation were investigated. The changes were determined in seeds, seedlings and plants. In barley cultivars also content of resorcinol, phloroglucinol and catechol type compounds (RFK) was estimated. TP content was determined with Folin-Ciocalteau´s reagent, RFK with p-dimethylaminocinnamaldehyde, phenolic acids by HPLC. UV-A irradiation was performed for 0, 24, 48 and 72 hours at l =351 nm, g - irradiation with 60Co at doses 0, 10, 20 and 40 Gy. During pea sprouting CP content increased, in barley cultivars CP stagnation was observed. UV-A irradiation caused in investigated plants an increase of CP content, g - irradiation enhanced CP content in barley but in pea decreased it. It was demonstrated statistical dependence of CP content on growth phases of plants and on doses of irradiation. RFK in sprouting seeds decreased but in further development of plants increased. UV-A and g - irradiation decreased RFK content in barley. Statistically significant dependence was found between RFK content and the doses of irradiation and the vegetation phase of plants. Cultivars responded differentially to various doses of irradiation in both types of irradiation. The most represented phenolic acids in pea and barley are 2,3-dihydroxybenzoic, sinapic, m-hydroxybenzoic, veratric and vanillic acids. UV-A irradiation caused apparent increase of these acids both in barley and pea, whereas g - irradiation caused only little changes in the content of these compounds.

Key words: UV-A irradiation; gamma irradiation; barley; pea; polyphenols; phenolcarboxylic acids; resorcinol, phloroglucinol and catechol

Úvod

Polyfenolické látky jsou přírodní látky, které jako sekundární metabolity jsou zastoupeny v každé vyšší rostlině a v každém jejím orgánu. Tyto látky představují mnoho typů sloučenin, např. flavonoidy, které lze dále rozdělit naflavony, flavonoly, isoflavony, chalkony, aurony, redukované flavanoly resp. flavan-3,4-dioly, dále pak fenolkarboxylové kyseliny a s nimi úzce spojené kumariny, anthokyanová barviva a jejich redukované formy leukoanthokyanidiny. Struktura a typ těchto látek jsou pro jednotlivé druhy rostlin charakteristické. Flavonoidy (převážně anthokyany, flavonoly, flavony, katecholy a flavanony), isoflavonoidy a ostatní polyfenoly (fenolkarboxylové kyseliny, lignany, stilbeny resp. dusík obsahující betalainy aj.) jsou silnými antioxidanty, které zachycují volné radikály a mají tzv. “scavenging effect” (R i c h a r d - F o r g e t et al., 1995). Polyfenoly se účastní biosyntéz jako přenašeče protonů, podílí se na výstavbě a zpevňování rostlinného těla (slouží jako prekursory pro lignin). Rostliny si je vytvářejí na obranu proti škůdcům a chorobám, neboť mnohé z nich mají značnou fungicidní, baktericidní i virocidní účinnost. Polyfenolické sloučeniny v obalových vrstvách semen (osemení, oplodí) chrání embryo klíčku před škodlivými vlnovými délkami ultrafialového záření, neboť jej pohlcují. Dalšími pravděpodobnými funkcemi polyfenolů je ochrana proti světlu, tvorba barevných složek semen, omezení klíčení zabráněním difúze plynu a pozdržení rozkladu obalů semene a plodů v půdě (C h a l k e r - S c o t t a K r a h m e r , 1989).

Literární přehled

L i u et al. (1995) sledovali vliv UV-B záření (280 - 320 nm) na aktivitu enzymů druhotného fenolického metabolismu v listech ječmene a na hladinu polyfenolických látek. Došli k závěru, že UV-B záření zpočátku nepatrně ovlivňuje aktivitu peroxidázy a chalkon-flavanon isomerázy, ale po 20 dnech výrazně až o 40 %. Aktivita fenylalaninlyázy (PAL) vzrostla po 5 dnech, ale potom poklesla a po 10 dnech byla neměřitelná ani u kontroly, jen u varianty s vyššími hodnotami UV-B se aktivita prodlužovala až do 15. dne. Dále zjistili, že UV-B záření zvyšuje akumulaci flavonoidů a ferulové kyseliny v ječmeni. B a l a k u m a r a S e l v a k u m a r (1998) zjistili, že celkový obsah polyfenolů se zvyšuje úměrně dávkám UV-B ozáření.

Gama záření (1-3 kGy) způsobilo akumulaci anthokyaninů v nadzemních částech Arabidopsis thaliana a tvorbu nových trichomů (N a g a t a et al., 1999). Jak zjistili A l - S a f a d i a S i m o n (1996), menší dávky g -záření (5 a 10 Gy) zvyšovaly klíčivost semen mrkve, vyšší dávky klíčení potlačovaly. Vzhledem k tomu, že rostliny jsou během vegetačního období vystaveny jak UV tak i g -záření především ve vyšších nadmořských výškách, je vliv slunečního UV-B záření a g -záření na rostliny pšenice a na obsah flavonoidů intenzivně zkoumán (H ä d e r, 1996, R a u, H o f m a n n, 1996, V e i t et al., 1995).

Cílem této práce bylo zjistit vliv UV-A záření (320 - 400 nm) a g -záření na hladiny polyfenolů, resorcinolu, floroglucinolu a katecholu a fenolkarboxylových kyselin v semenech, klíčících rostlinkách a rostlinách ječmene a hrachu.

Materiál a metody

Odrůdy ječmene (Krona a Kompact) a hrachu (Lantra a Menhir) získané na Katedře rostlinné výroby ČZU v r. 1999 byly ozařovány dvěmi druhy záření (UV-A, g -záření). Jako zdroj UV záření byla použita UV lampa o l =351 nm, 0, 24, 48 a 72 hod. Zdrojem g -záření byl izotop 60Co (0, 10, 20 a 40 Gy; ozářeno na LF UK, Hradec Králové).Vzorky ječmene a hrachu byly ozařovány v následujících variantách:

2. suché, nenaklíčené osivo (po ozáření 2 měsíce skladováno při laboratorní teplotě),

7. naklíčené osivo (10 hodin máčené v destilované vodě a vyseté na povrch půdy; po 5 dnech naklíčení byla naklíčená semena vystavena ozáření a po 7 dnech pěstování analyzována),

8. vzrostlé rostliny (osivo vyseté přímo do půdy v květináčích); po 21 dnech byly rostliny ozařovány (UV po 72 hod., g -záření po 4 hod. celkově) a po skončení ozařování 7 dní dopěstovány před analýzou.

Stanovení celkových polyfenolů (CP): Semena a usušené rostliny byly rozemlety na mlýnku, rozemletá hmota byla převedena do patron Soxhletova extrakčního přístroje a byla extrahována 80%-ním vodným ethanolem po dobu 20 hod. Po doplnění extraktu na 250 ml bylo pipetováno 10 ml do 50 ml odměrných baněk. Po zředění destilovanou vodou na objem cca 30 ml bylo přidáno 2,5 ml Folin-Ciocalteuova činidla p.a. Po promíchání a po 3 minutách bylo přidáno 7,5 ml 20%-ního roztoku uhličitanu sodného p.a. a objem byl doplněn po značku destilovanou vodou. Po řádném promíchání byla tvorba barevného komplexu ukončena po 2 hodinách stání a poté byla změřena absorbance modře zbarveného roztoku v kyvetách o síle vrstvy 0,5 cm při vlnové délce l =765 nm na Spekolu 11 proti slepému pokusu. Polyfenolické látky byly vyjádřeny jako gallová kyselina a přepočítány na sušinu (u semen).

Stanovení polyfenolických látek typu resorcinolu, floroglucinolu a katecholu(RFK): Z vodně-ethanolického výluhu bylo ke stanovení pipetováno 25 ml vzorku. Alikvotní podíly byly odpařeny na vodní lázni na miskách do sucha. Odparky byly redisolvovány v 15 ml methanolu a převedeny kvantitativně do 25 ml odměrných baněk. Do každé baňky bylo pipetováno 6 ml 3M HCl v methanolu a po promíchání doplněno po značku bezvodým methanolem. K těmto 25 ml roztoku byl přidán 1 ml roztoku p-dimethylaminoskořicového aldehydu p.a. (Merck, SRN), roztok byl promíchán a ponechán 30 minut stát. Poté byla změřena absorbance v 0,5 cm kyvetách při vlnové délce 638 nm na Spekolu 11 oproti slepému pokusu. Obsah resorcinolových, floroglucinolových a katecholových jader byl se vyjádřen jako floroglucinol.

Stanovení sušiny: Bylo provedeno metodikou dle D a v í d k a et al. (1977): 2 g jemně umletého vzorku byly odváženy do kovové váženky a sušeny do konstantní hmotnosti při 105°C.

Stanovení polyfenolických látek metodou HPLC: Pro bližší identifikaci polyfenolických sloučenin z vodně-ethanolických extraktů bylo využito vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) s gradientovou elucí od firmy Waters TM (stavebnicový systém - čerpadlo Waters TM 600S, autosampler Waters TM 717 plus, detektor Waters TM PDA 996 - UV-VIS ) pro identifikaci v UV a viditelné oblasti. Byla použita kolona Watrex 250x4 mm Separon SGX C18 (7 m m) a mobilní fáze: A - 5% vodný methanol, B - 40% vodný methanol (oba roztoky upraveny s H3PO4 na pH 2,5); průtok 1 ml.min-1. Standardy fenolkarboxylových kyselin a kumarinů byly od fy. Fluka Chemie AG, Buchs, Švýcarsko.

Výsledky

UV-A záření mělo statisticky významný vliv na obsah CP a rovněž vegetační fáze rostliny ovlivnila obsah CP po ozáření. Semena obsahovala nízké hladiny CP, u naklíčených semen a rostlin byly nalezeny mnohem vyšší obsahy (Tab. I). UV-A záření zvýšilo významně obsah CP (Tab. II). g -Záření způsobilo v dávkách 40 Gy snížení CP u odrůdy Lantra o 9 %rel, u ječmene Kompact o 15 %rel. U ostatních odrůd hrachu a ječmene byl zjištěn nárůst CP (hrách Menhir o 15 %rel, ječmen Krona o 46 %rel.). Analogicky u naklíčených semen byl obsah CP při dávkách 40 Gy snížen (Menhir o 28 %rel, Kompact o 5 %rel). Menší dávky ozáření (20 Gy) naopak zvyšovaly obsah CP (u ječmene Kompact o 11 %rel, Krona o 57 %rel).

Pomocí HPLC byly v ječmeni identifikovány kyseliny: 3,5-dihydroxybenzoová, o-kumarová, gallová, kávová, sinapová, ferulová, vanillová, veratrová a skořicová, v hrachu 2,3-dihydroxybenzoová, sinapová, vanillová, veratrová, kávová, 3,5-dihydroxybenzoová, o-kumarová a ferulová. Z kumarinů byl v hrachu identifikován kumarin, v ječmeni kumarin a 7-methoxykumarin. V obou odrůdách hrachu nejvíce zastoupeny byly kyseliny 2,3-dihydroxybenzoová a m-hydroxybenzoová, u ječmene 2,3-dihydroxybenzoová, sinapová, vanillová a veratrová. UV-A ozáření způsobilo nárůst hladin fenolických kyselin. U hrachu došlo k největšímu nárůstu u 2,3-dihydroxybenzoové kyseliny, kávové a sinapové kyseliny, u ječmene u sinapové a vanillové kyseliny.

Látky typu RFK byly nalezeny pouze u ječmene (Tab. III). Během klíčení jejich obsah klesal, avšak u rostlin byl vyšší (Tab. IV). g -Záření mělo za následek snížení obsahu látek typu resorcinolu, floroglucinolu a katecholu (Tab. V).

Diskuse

Ze získaných výsledků vyplývá, že rovněž UV-A záření způsobuje nárůst CP, což je v souhlase s poznatky získanými pro UV-B záření (L i u et al., 1995, B a l a k u m a r a S e l v a k u m a r, 1998). Nárůst celkového obsahu polyfenolických látek a fenolkarboxylových kyselin po ozáření UV-A zářením potvrzuje jejich ochrannou roli proti poškození škodlivými vlnovými délkami (M i d d l e t o n a T e r a m u r a, 1993). Tyto látky chrání DNA před indukcí radiačního poškození (S t a p l e t o n a W a l b o t, 1994). Fenolické ochranné filtry jsou nejvíce účinné proti vlnovým délkám, které v závislosti na ozonové vrstvě dopadají na biosféru (M a z z a et al., 2000).

g -Záření způsobovalo pouze malé zvýšení obsahu fenolických kyselin v porovnání s UV zářením. U hrachu odrůdy Lantra bylo zjištěno zvýšení obsahu 2,3-dihydroxybenzoové a kávové kyseliny, u odrůdy Menhir m-hydroxybenzoové kyseliny v semenech a sinapové v naklíčených semenech a rostlinách. U ječmene odrůdy Kompact bylo po g -ozáření zjištěno zvýšení 2,3-dihydroxybenzoové kyseliny v semenech (o 440 %) a 3,4-dihydroxybenzoové kyseliny v naklíčených semenech, u odrůdy Krona 3,4-dihydroxybenzoové v naklíčených semenech (o 50 - 100 %) a vanillové v rostlinách (o 40 - 250 %). Nalezené formy jednoduchých fenolických kyselin potvrzují konverzi konjugovaných forem na jednodušší (P e n d h a r k a r a N a i r, 1995) působením g -záření.

Zvýšený obsah celkových polyfenolů spolu s inhibicí aktivity polyfenoloxidáz (PFO) naznačuje, že při ozáření UV zářením rostliny zvyšují obsah CP snížením aktivity PFO (B a l a k u m a r a S e l v a k u m a r, 1998) a mohou sloužit jako neenzymatické antioxidanty.

Závěr

Během klíčení se obsah CP zvyšoval, u ječmene nebyla nalezena výrazná změna. UV-A ozáření způsobilo významné zvýšení CP u ječmene i hrachu, zatímco g -záření u ječmene obsah CP zvyšovalo a u hrachu snižovalo. Obsah RFK se při klíčení snižoval, avšak během dalšího růstu rostlin narůstal. U ječmene se vlivem UV-A a g -záření obsah RFK snižoval v závislosti na dávce ozáření. UV-A záření způsobilo značné zvýšení fenolkarboxylových kyselin u ječmene i hrachu, g -záření způsobilo pouze malé změny v jejich obsahu. Jako dominantní kyseliny byly v ječmeni i hrachu nalezeny 2,3-dihydroxybenzoová, sinapová, m-hydroxybenzoová, veratrová a vanillová kyselina. Tyto látky působí jako ochranné filtry proti škodlivým délkám UV záření a jako antioxidanty superoxidových a dalších kyslíkových radikálů. Jejich obsah je závislý na intenzitě ozáření, odrůdě a vegetačním stadiu.

Použitá literatura

AL-SAFADI, B. - SIMON, P.W.: Gamma irradiation - induced variation in carrots (Daucus carota L.). J. Amer. Soc. Hort. Sci. 121, 1996: 599-603.

BALAKUMAR, T. - SELVAKUMAR, V.: Phenol metabolism as a potential protective mechanism against UV-B radiation - induced oxidative stress in plants. Polyphenol Communications 98, XIXth Inter. Conf. on Polyphenols, eds. CHARBONNIER, F., DELACOTTE, J.M., POLANDO, C., Lille,1998: 469-470.

DAVÍDEK, J. - HRDLIČKA, J. - KARVÁNEK, M. - POKORNÝ, J. - SEIFERT, J. - VELÍŠEK, J.: Laboratorní příručka analýzy potravin. SNTL Praha, 1977.

HÄDER, D.P.: Effects of solar radiation on local and German wheat seedlings in a Chilean high mountain station. J. Photochem. Photobiol. B, Biol. 35, 1996: 181-187.

LIU, L. - Mc CLURE, J.W.: Effects of UV-B activities of enzymes of secondary phenolic metabolism in barley primary leaves. Physiol. Plant 93, 1995: 734-739.

MAZZA, C.A. - BOCCALANDRO, H.E. - GIORDANO, C.V. - BATTISTA, D. - SCOPEL, A.L. - BALLARÉ, C.L.: Functional significance and induction by solar radiation of ultraviolet-absorbing sunscreens in field-grown soybean crops. Plant Physiol. 122, 2000: 117-126.

MIDDLETON, E.M. - TERAMURA, A.H.: The role of flavonol glycosides and carotenoids in protecting soybean from ultraviolet-B damage. Plant Physiol. 103, 1993: 741-752.

NAGATA, T. - TODORIKI, S. - HAYASHI, T. - SHIBATA, Y. - MORI, M. - KANEGAE, H. - KIKUCHI, S.: g -Radiation induces leaf trichome formation in Arabidopsis. Plant Physiol. 120, 1999: 113-120.

PENDHARKAR, M.B. - NAIR, P.M.: A comparative study of phenylpropanoid metabolism in gamma irradiated and unirradiated potato tubers. Potato Res. 38, 1995: 187-198.

RAU, W. - HOFMANN, H.: Sensitivity to UV-B of plants growing in different altitudes in the Alps. J. Plant Physiol. 148, 1996: 21-25.

STAPLETON, A.E. - WALBOT, V.: Flavonoids can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage. Plant Physiol. 105, 1994: 881-889.

VEIT, M. - BILGER, W. - MÜHLBAUER, T. - BRUMMET, W. - WINTER, K.: Diurnal variation in UV-protective flavonoids. Plant Physiol. 148, 1995: 478-482.

Poděkování: Tato práce byla podpořena Výzkumným záměrem MSM 412100002 AF ČZU Praha a interním grantem 202/10/36500/0 ČZU Praha

Kontaktní adresa

Ing. Matyáš Orsák, Katedra chemie, Agronomická fakulta, Česká zemědělská univerzita, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 - Suchdol, tel. 02/2438-2721, fax 02/2092 1648, E-mail: orsak@af.czu.cz

I. Obsah CP [mg.kg -1 sušiny].

II. Změny obsahu CP [%] vyvolané UV a g - zářením.

S - semena; Ns - naklíčená semena; R - rostliny; * - uhynulé rostliny

III. Obsah RFK v ječmeni [ mg. kg -1 sušiny] .

IV. Změny obsahu RFK v ječmeni [ %] vyvolané UV - zářením.

V. Změny obsahu RFK v ječmeni [ %] vyvolané g -zářením.