DETEKCE MI GENU U DRUHU LYCOPERSICON ESCULENTUM

Detection of Mi Gene in Lycopersicon esculentum

Sylva Skupinová, Pavel Vejl, Petr Sedlák, Miloslav Zouhar, Martina Bardová

Česká zemědělská univerzita v Praze, Agronomická fakulta

Souhrn, klíčová slova

Byly vyhodnoceny genové zdroje - odrůdy typu F1 generace a segregující F2 generace. Z meristématických pletiv obou taxonů byla izolována DNA metodou CTAB dle SAGHAI-MAROOF et al. (1984), SKUPINOVÁ (1998), VEJL (1998). Pro dominantně založenou rezistenci rajčete vůči Meloidogyne incognita byl použit kodominantní CAPS marker Mi genu. Experimenty vycházely z pokusů WILLIAMSON et al. (1994). Detekce dominantních a recesivních alel byla provedena po digesci primárního PCR produktu restrikčním enzymem TaqI. Nalezené PCR markery rezistence u rajčete byly konfrontovány s výsledky standardních infekčních testů.

U druhu rajče byly detekovány heterozygotní sestavy genu Mi u dvou odrůd typu F1 hybrid. Kodominantní CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) marker jednoznačně umožnil rozlišení heterozygotů, dominantních a recesivních homozygotů. U obou odrůd bylo zajištěno samoopylení a byla získána generace F2. Tato generace byla podrobena segregační analýze. Rostliny této generace byly rovněž použity pro standardní infekční testy. Získaný štěpný poměr CAPS markerů byl statisticky porovnán s předpokládanou segregací c 2 testem. Statisticky byla rovněž ověřena shoda štěpení CAPS markerů a štěpení rostlin v infekčních testech.

Optimalizovanou metodiku detekce rezistence rajčete vůči půdním nematodám lze považovat za metodický postup využitelný ve šlechtitelské praxi. Rychlost molekulárněgenetické metody, její expresivita a statisticky průkazná shoda s výsledky infekčních testů jsou přesvědčivým důkazem pro aplikaci metody v praxi.

Klíčová slova: rajče, Lycopersicon esculentum, Mi geny, rezistence, Meloidogyne incognita, CAPS markery, PCR

Summary, keywords

This paper presents the scope of using co-dominant DNA markers in the detection of Mi gene of the Lycopersicon esculentum, resistant against parasitic soil nematodes of the Meloidogyne incognita.

In this experiment was assessed for gene sources - varieties of the F1 generation type and the segregating F2 generation. By using of the method modified by SAGHAI-MAROOF et al. (1984), SKUPINOVÁ (1998), VEJL (1998) DNA was isolated from the meristematic tissues. For the dominantly established tomatos resistance against Meloidogyne incognita was used a co-dominant CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) marker of the Mi gene. The experiments were based on tests by WILLIAMSON et al. (1994). Dominant and recessive alleles were detected after the digestion of the primary PCR product by the restriction enzyme TaqI. The identified PCR resistance markers in the Lycopersicon esculentum were confronted with the results of standard infection tests. Heterozygous sets of the Mi gene were detected in two species of the F1 hybrid type. The co-dominant CAPS marker enabled an unambiguous distinction between heterozygotes and dominant and recessive homozygotes. In tomato self-pollination occurred, and an F2 generation was obtained. This generation was subjected to a bulked segregation analysis. The plants of this generation were also subjected to standard infection tests. The segregation ratio of the obtained CAPS markers was statistically compared with the assumed segregation using the c 2 test. Statistically verified was also the correspondence of the CAPS markers segregation with the segregation of plants determined in the infection tests.

This optimised methodology of detecting the resistance of the Lycopersicon esculentum genus against Meloidogyne incognita can be regarded as a methodical procedure applicable in the breeding practice. The speed of the molecular genetic method, its expressiveness and statistically demonstrable correspondence with the results obtained from infection tests, are a convincing evidence of the methods applicability in practice.

Key words: tomato, Lycopersicon esculentum, Mi genes, resistance, Meloidogyne incognita, CAPS markers, PCR

Úvod

DNA markery je v současné době možné považovat za aktuální trend ve šlechtění rostlin. Pomocí DNA markerů lze jednoznačně a spolehlivě detekovat konkrétní genotyp a selektovat požadované jedince bez ovlivnění vnějšího prostředí. V případě rezistentního šlechtění jsou markery napomáhající selekci (MAS - marker assisted selection) ještě významnější, protože eliminují přímý kontakt s patogeny a škůdci, který je při infekčních testech nevyhnutelný. V tomto příspěvku jsou prezentovány možnosti využití kodominantních DNA markerů pro detekci genu rezistence rajčete vůči parazitickým půdním nematodám Meloidogyne incognita.

Literární přehled

Rezistentní šlechtění je všeobecně chápáno jako jedna z nejúčinnějších metod v ochraně rostlin před řadou chorob a škůdců (ROD et al., 1982). V současné době je stále častěji využíváno molekulárněgenetických metod pro detekci markerů genů rezistence nebo detekci vlastních genů řídících rezistenci či senzitivitu testovaného genomu. V procesu tvorby nových odrůd se stále častěji využívají takzvané markery napomáhajících selekci (MAS - marker assisted selection).

Donorem genu rezistence (Mi) je považován druh Lycopersicon peruvianum. Tento majorgen rezistence poprvé publikoval GILBERT a MCGUIRE (1956). Komplex genů rezistencí pocházejících z Lycopersicon peruvianum studovali mimo jiných VEREMIS a ROBERTS (1996). V pozdější době bylo detekováno více Mi genů (Mi1, Mi2, Mi3). Tyto geny byly lokalizovány na krátkém rameni chromozómu VI a v pericentromerické oblasti téhož chromozómu druhu Lycopersicon esculentum (WORDRAGEN et al., 1994). Mechanismus účinku těchto genů detailně popisuje MILLIGAN et al. (1998) a přehled o využitelných Mi genech podává WILLIAMSON (1998). Vyhledávání nových genů rezistence rodu Lycopersicon vůči háďátkům rodu Meloidogyne popisuje AMATI et al. (1985). Studiem Mi genů rezistence u rodu Lycopersicon se zabývali rovněž ROBERTS et al. (1990) a CATAGNOE - SERENO et al. (1993). Vlastní detekce genů, jejich markerování a mapování představuje výrazné urychlení šlechtitelského procesu. K těmto cílům je obvykle využíváno genetických markerů založených na principu délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP) nebo polymerázové řetězové reakce (PCR). Využití PCR pro detekci kodominantního markeru genu Mi detailně popisuje WILLIAMSON et al. (1994) a YAGHOOBI et al. (1995). Genetickými a segregačními analýzami bylo prokázáno, že majorgen Mi je v těsné vazbě s genem odpovídajícím za rezistenci vůči mšicím. Selekce na bázi markerů Mi genů rezistence vůči Meloidogyne incognita umožňuje současně vybírat genotypy odolné vůči mšicím. Tuto těsnou genovou vazbu studovali a potvrdili KALOSHIAN et al. (1995), VOS et al. (1998) a FAZAL et al. (1994). Celý proces rezistentního šlechtění včetně výstupů - rezistentních odrůd publikuje BOSCH et al. (1990).

Metody

Byly vyhodnoceny genové zdroje - odrůdy typu F1 generace a segregující F2 generace. Z meristématických pletiv obou taxonů byla izolována DNA metodou CTAB dle SAGHAI-MAROOF et al. (1984), SKUPINOVÁ (1998), VEJL (1998). Pro dominantně založenou rezistenci rajčete vůči Meloidogyne incognita byl použit kodominantní CAPS marker Mi genu dle WILLIAMSON et al. (1994).

Sekvence použitých primerů uvádí tabulka 1, teplotní a časový profil PCR udává tabulka 2, podmínky amplifikace jsou uvedeny v tabulce 3. Celkový objem reakční směsi činil 25 ml. Detekce dominantních a recesivních alel byla provedena po digesci primárního PCR produktu restrikčním enzymem TaqI. Do 10 ml primárního PCR produktu bylo přidáno 0,7 ml TaqI a 1,1 ml pufru. Digesce probíhala po dobu 150 minut při teplotě 65°C. Elektroforetická separace probíhala po dobu 90 minut, byl použit 1,5% agarózový gel. Genotypová a fenotypová segregace F2 generace byla vyhodnocena c 2 testem. Nalezené PCR markery rezistence u rajčete byly konfrontovány s výsledky standardních infekčních testů, kdy rostliny rajčat byly ve fázi čtyř pravých listů přesazeny do zamořené půdy. Po 110 dnech bylo provedeno vyhodnocení napadení kořenů.

Tabulka 1: Sekvence použitých primerů

Tabulka 2: Teplotní a časový profil PCR (modifikace dle Williamson et al. (1994))

Tabulka 3: Podmínky PCR (modifikace dle Williamson et al. (1994))

Výsledky

Výsledky segregační analýzy testovaných genotypů jsou uvedeny na obrázcích 1 a 2. Příklady analýz kořenů po 110 dnech kultivace v infikované půdě uvádí obrázek 3. U všech recesivně homozygotních jedinců identifikovaných molekulárněgenetickou analýzou DNA pomocí CAPS markeru bylo nalezeno velké množství hálek na kořenech. U všech nalezených dominantních genotypů byl infekční test negativní. Molekulárněgenetická analýza DNA jednoznačně rozlišila dominantní genotypy na dominantní homozygoty a heterozygoty.

Obrázek 1: Segregační analýza v F2 štěpící generaci odrůdy Nema, detekce Mi genu pomocí CAPS markeru (Williamson et al., 1994)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 S

1-19: dráhy elektroforeogramu:

- 11, 14, 15, 16, 19: dominantně homozygotní sestava genu Mi

- 1, 2, 4, 5, 7, 10, 12, 13, 18: heterozygotní sestava genu Mi

- 3, 6, 8, 9, 17: recesivně homozygotní sestava genu Mi

S: hmotnostní standard [Lambda DNA/Eco47I (AvaII)]

Obrázek 2: Segregační analýza v F2 štěpící generaci odrůdy Petopride, detekce Mi genu pomocí CAPS markeru (Williamson et al., 1994)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 S

1-19: dráhy elektroforeogramu:

- 10, 12, 14, 18: dominantně homozygotní sestava genu Mi

- 1-7, 13, 15, 16: heterozygotní sestava genu Mi

- 8, 9, 17, 19: recesivně homozygotní sestava genu Mi

S: velikostní standard [Lambda DNA/Eco47I (AvaII)]

Obrázek 3: A - příklad kořenů senzitivní rostliny (recesivní homozygot) B - příklad kořenů rezistentní rostliny (dominantní homozygot, heterozygot)

A B

Shodu teoretické a skutečně nalezené genotypové a fenotypové segragace F2 generace testovaných odrůd vyhodnocené c 2 testem uvádí tabulka 4. Z uvedeného statistického hodnocení vyplývá vysoká pravděpodobnost, se kterou se nalezené poměry shodují s poměry teoreticky očekávanými.

Tabulka 4: Výsledky c 2 testu - shoda mezi teoretickou a skutečnou segregací

Diskuse

Výsledky molekulárněgenetické analýzy DNA pomocí CAPS markerů jednoznačně korespondují s výsledky expeimentů WILLIAMSON et al. (1994). YAGHOOBI (1995) ve svých pokusech využil jiný typ CAPS markerů, kterými lze rovněž jednoznačně rozlišit genotypy v Mi genu. Použitý restrikční enzym AccI je však cenově méně výhodný.

Vyhodnocení infekčními testy potvrdilo rezistenci dominantních homozygotů a heterozygotů a senzitivitu recesivních homozygotů. Infekční testy jsou poměrně zdlouhavé, náročné na skleníkové prostory a nelze jimi rozlišit vlivem úplné dominance Mi genu dominantní sestavy.

Z výsledků experimentu vyplývá velká výhoda rychlých a přesných analýz DNA s využitím CAPS markerů, kdy jednoznačná detekce dominantních homozygotů v průběhu šlechtitelského procesu vede k zefektivnění celého procesu tvorby nových odrůd rezistentních vůči Meloidogyne incognita. Vysoká pravděpodobnost shody skutečné a teoreticky očekávané fenotypové a zejména genotypové segregace F2 generace vyhodnocené c 2 testem potvrzuje monogenní dědičnost a s vysokou pravděpodobností zaručuje přítomnost 25 % dominantních homozygotů v Mi genu ve štěpící generaci. Dominantní homozygoty lze následně detekovat CAPS markery.

Závěr (praktické doporučení)

Molekulárněgenetickou analýzou DNA s využitím CAPS markerů lze rychle a jednoznačně identifikovat všechny genotypové setavy Mi genu. Metoda rychle a přesně poskytuje pro šlechtitelskou praxi důležitou detekci dominantních homozygotů v Mi genu s cílem získání rezistentních odrůd rajčat proti háďátku Meloidogyne incognita. Výhodou využití CAPS markerů je rychlost a přesnost, nevýhodou je vyšší cenová náročnost. Na základě statistického vyhodnocení se shodují skutečně získané štěpné poměry s teoreticky očekávanými a lze ve štěpící generaci očekávat 25% zastoupení dominantních homozygotů.

Použitá literatura

AMMATI, M.- THOMASON, I.J. - ROBERTS, P.A.: Screening Lycopersicon spp. for new genes imparting resistance to root-knot nematodes (Meloidogyne spp.). Plant disease, 69 (2), 1985, 2,112-115.

BOSCH,S.E. - BOELEMA, B.H. - SERFONTEIN, J.J. - SWANEPOEL, A.E.: “Rotam 4”, a multiple disease-resistant fresh-market tomato. HortScience, 25(10), 1990, 10, 1313-1314.

CASTAGNONE-SERENO, P. - BONGIOVANNI, M. - DALMASSO, A. : Stable virulence against the tomato resistance Mi gene in the parthenogenetic root-knot nematode Meloidogyne incognita. Phytopathology, 83 (8), 1993, 8, 803-805.

FAZAL, M. - SHAH, N.H. - IMRAN, M. - SIDDIQUI, Z.A. : Responses of some tomato cultivars to root-knot nematode Meloidogyne incognita. Tests of agrochemicals and cultivars, (15), 1994, 6, 126-127.

GILBERT, J.C.- MCGURIE, D. C.: Inheritance of resistance to severe root-knot from Meloidogyne incognita in commercialtype tomatoes. Proc Am Soc Hort Sci, 63,1956, 437-442.

KALOSHIAN, I. - LANGE, W.H. - WILLIAMSON, V.M. : An aphid-resistance locus is tightly linked to the nematode-resistance gene, Mi, in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92 (2), 1995, 1, 622-625.

MILLIGAN, S.B.- BODEAU, J.- YAGHOOBI, J.- KALOSHIAN, I.- YABEL, P.- WILLIAMSON, V.M.:The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper, nucleotide binding, leucine-rich repeat family of plat genes. The plant cell, 10(8), 1998, 8, 1307-1319.

ROBERTS, P.A. - DALMASSO, A. - CAP, G.B. - CASTAGNONE-SERENO, P. : Resistance in Lycopersicon peruvianum to isolates of Mi gene-compatible Meloidogyne populations. Journal of nematology, 22 (4), 1990, 10, 585-589.

ROD, J.: Šlechtění rostlin. Praha, SZN, 1982.

SAGHAI-MAROOF, M. A. - SOLIMAN, K. M. - JORGENSEN, R.A. - ALLARD, R.V.: Ribosomal DNA spacer-lenght polymorphism in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, 8014-8019.

SKUPINOVÁ, S.: Úloha odrůdy ve zdravé výživě. Doktorská disertační práce, AF ČZU v Praze, 1998.

VEJL, P.: Využití genetických markerů pro tvorbu dihaploidů pšenice obecné (Triticum aestivum, L.). Doktorská disertační práce, AF ČZU v Praze, 1998.

VEREMIS, J.C. - ROBERTS,P.A.: Identification of resistance to Meloidogyne javanica in the Lycopersicon peruvianum complex. Theoretical and applied genetics, 93 (5/6), 1996, 10, 894-901.

VOS, P.- SIMONS, G.- JESSE, T.- WIJBRANDI, J.- HEINEN, L. - HOGERS, R.- FRIJTERS, A.- GROENENDIJK, J.- DIERGAARDE, P.- REIJANS, M.- FIERENS-ONSTENK, J.: The tomato Mi-1 gene confers resistance to both root-knot nematodes and potato aphids. Nature biotechnology, 16(13), 1998, 10, 1365-1369.

WILLIAMSON, V.M. - HO, J.Y. - WU, F.F. - MILLER, N. - KALOSHIAN, I. : A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene, Mi in tomato. Theoretical and applied genetics, 87 (7), 1994, 2, 757-763.

WILLIAMSON, V.M.: Root-knot nematode resistance genes in tomato and their potential for future use. Annual review of phytopathology, 36, 1998, 277-293.

WORDRAGEN, M.F. VAN- WEIDE, R.- LIHARSKA, T.- STEEN, A. VAN DER.- KOORNNEEF, M.- ZABEL, P.: Genetic and molecular organization of the short arm and pericentromeric region of tomato chromosome 6. Euphytica : Netherlands journal of plant breeding, 79(3), 1994, 169-174.

YAGHOOOBI, J. - KALOSHIAN, I. - WEN, Y. - WILLIAMSON, V.M.: Mapping a new nematode resistance locus in Lycopersion peruvianum. Theoretical and applied genetics 91(3),1995,8,457-464.

Kontaktní adresa

Dr. Ing. Sylva Skupinová,

Česká zemědělská univerzita v Praze, AF, Katedra genetiky a obecné zootechniky, Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 - Suchdol

Tel.: 02/24382560, e - mail: skupinova@af.czu.cz

Řešitelé děkují šlechtitelské firmě Moravoseed spol. s r. o. za poskytnutý pokusný materiál a za sponzorování vědeckovýzkumné práce v oblasti molekulárněgenetické analýzy genomu druhu Lycopersicon esculentum.

Práce je podporována výzkumným záměrem MSM 412100002 a projektem GA ČZU 232/10/36600/0.