VYUŽITÍ RAPD MARKERŮ PRO DETEKCI GENU MLO JEČMENE OBECNÉHO (HORDEUM VULGARE L.)

06.12.2000 | Odborné konference

Using of RAPD markers to Mlo locus detection in barley (Hordeum vulgare L.)

Vopršal, J. - Vejl, P. - Skupinová, S.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Souhrn, klíčová slova

Genetické markery založené na RAPD metodě byly využity pro detekci genu rezistence k padlí travnímu mlo. V modelovém souboru 10 odrůd ječmene obecného (Hordeum vulgare L.) bylo zastoupeno 7 odrůd nesoucích gen mlo a 3 odrůdy náchylné k tomuto patogenu. Složení reakčních komponent bylo optimalizováno, teplotní a časový profil RAPD reakce a použité primery byly shodné s prací Manninen et al. (1997). Produkty byly separovány v agarózovém gelu a barveny ethidium bromidem. Každý z testovaných primerů RAPD reakce (H1, H2, H3) umožnil amplifikaci specifické zóny o velikosti 780bp, resp. 470 a 480bp, resp. 2000bp, které identifikovaly přítomnost alely mlo11.

Klíčová slova: Ječmen, Erysiphe graminis f. sp. hordei, RAPD marker, patogen

Summary, keywords

Genetic markers based on RAPD was used to mlo locus detection. In used collection of ten spring barley (Hordeum vulgare L.) varieties were seven varieties with mlo resistance gene against powder mildew and three varieties sensitive to this pathogen. Content of reaction components was optimised. Temperature and time profiles of RAPD and applicated primers were used according Manninen et al. (1997). The products were separated in agarose gel and gels where stained by ethidium bromide. Primers (H1, H2, H3) for RAPD reactions where used. These primers amplificated the following specific bands: 780bp (H1), 470bp and 480bp (H2), 2000bp (H3). These bands identified presence of mlo11 locus.

Keywords: Barley, Erysiphe graminis f. sp. hordei, RAPD marker, pathogen

Úvod

Biochemicko-genetické markery jsou vedle využívání klasických metod ve šlechtění rostlin vhodným doplňkem umožňující charakterizovat genetickou variabilitu různých organismů. Lze jimi sledovat přítomnost či absenci studovaného znaku.

Literární přehled

Padlí travní (Erysiphe graminis f. sp. hordei) patří k nejdůležitějším listovým chorobám ječmene. V populaci hostitelského rodu - ječmen se v průběhu evoluce vytvořily formy s různou odolností vůči tomuto patogenovi. Následně pak v populaci patogena vznikají patotypy schopné překonávat příslušné geny odolnosti. Zatím byla překonána většina rezistencí, s výjimkou genu mlo (Dreiseitl, 1989, 1991; Špunar, 1996; Dreiseitl a Pařízek, 1993). Alternativou morfologických a dalších hodnocených znaků jsou biochemicko-genetické markery. Law (1995) shrnuje možnosti použití biochemicko-genetických markerů ve šlechtění rostlin následovně: MAS (Marker Assisted Selection) - selekce s použitím markerů, markerování a lokalizace genů pro kvalitativní a kvantitativní znaky, mapování genomu.

Využití hordeinových bílkovin ječmene jako markerů odolnosti ječmene k padlí travnímu studoval Pomorcev et al. (1983); Sozinov (1985). Vztah mezi proměnlivostí hordeinů a odolností k padlí travnímu studoval Černý et al. (1999), který na hodnoceném souboru jarního a ozimého ječmene stanovil na základě koeficientu asociace možné markery rezistence k padlí travnímu. Schopnost markerovat rezistenci k padlí travnímu projevují alely A12 a B(17). Alely B17 a B-N se jeví jako markery k náchylnosti k padlí travnímu.

Historicky novější DNA markery, založené na postupu RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), jsou vhodné ke stanovení genetické variability na úrovni DNA s cílem zlepšit identifikaci genů rezistence (Jahoor a Mohler, 1996). Bylo identifikováno mnoho rezistencí, ale jen pro některé byl stanoven alelismus nebo těsná vazba s již známými lokusy pro rezistenci k padlí (Jahoor a Fishbeck, 1987; Schü ller et al., 1992; Schö nfeld et al., 1996). Heun (1992) mapoval u ječmene (Hordeum vulgare L.) oblast genu rezistence Mla12 k Erysiphe graminis f. sp. hordei na chromozomu 5. Maroof et al. (1994) pomocí RFLP markerů rovněž identifikoval geny rezistence ječmene k této chorobě. Získal 84 markerů o celkové vzdálenosti 1100 cM rozdělených na chromozomu 2 a 6. Xu a Kasha (1992) detekovali metodou PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaktion - Random Amplified Polymorphic DNA) dominantní gen rezistence k padlí travnímu přenesený z H. bulbosum do genomu H. vulgare. Manninen et al. (1997) identifikoval RAPD markery ječmene, které jsou v těsné vazbě s alelou mlo11.

Metody

Pro detekci alely mlo11 pomocí RAPD markerů bylo analyzováno celkem 10 odrůd jarní formy ječmene obecného (Hordeum vulgare L.). Do tohoto souboru bylo zařazeno 7 odrůd (1 Atribut, 2 Forum, 3 Krona, 4 Olbram, 5 Ditta, 6 Heris, 7 Nordus) nesoucích ve svém genomu gen rezistence mlo, zbývající 3 odrůdy (8 Amulet, 9 Lumar, 10 Pax) byly náchylné k padlí travnímu. DNA byla izolována modifikovanou fenolovou metodou dle Saghai-Maroof et al. (1984) za použití CTAB (cetyltrimetyl-bromid amonný) extrakčního pufru. Pro stanovení koncentrace a celkového množství DNA v roztoku bylo použito UV spektrofotometrické absorpční metody. Čistota izolované DNA byla zjištěna na základě poměru absorbance DNA (A260=260nm) a proteinů (A280=280nm). Kvalita izolované DNA (vysokomolekularita) byla ověřena pomocí elektroforetické separace v 0,8% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze.

Teplotní a časový profil RAPD reakce uvádí Manninen et al. (1997). Složení reakčních komponent pro 50m l reakci bylo následující: templátová DNA 30ng, vybraný primer 0,01mM, rekombinantní Taq polymeráza (MBI Fermentas, Litva) 1,5U, dNTP 100m M, MgCl2 1,5mM, Tris HCl (pH8,8) 10mM, KCl 50mM, Nonidet P40 0,08%. Reakční směs byla převrstvena 20m l minerálního oleje. Pro amplifikaci DNA byl použit termocykler Cyclogene (Techne, Velká Británie). Produkty RAPD reakce byly separovány v 1,5% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze při konstantní hodnotě napětí 100 V po dobu 150 minut. Po navázání molekulárního barviva ethidium bromidu na RAPD produkty byl tento komplex vizualizován na UV transiluminátoru. Vizualizované elektroforeogramy byly fotografovány, digitalizovány a po korekci programem iPhoto Plus version 1.1 byly uloženy ve formě * .TIF souborů.

Výsledky

DNA izolovaná z rostlinného materiálu byla ve všech analyzovaných vzorcích vysokomolekulární. Čistota DNA byla vyjádřena poměrem absorbance A260/A280, který dosahoval hodnot v intervalu 1,7-2,1.

Pro detekci alely mlo11 u vybraného souboru odrůd byly použity tři primery publikované Manninen et al. (1997). Primer označený H1 (5´-GAT GAC CGC C-3´) poskytoval specifický produkt o velikosti 780 bp. Tento fragment představuje marker přítomnosti alely mlo11. Výskyt tohoto markeru byl zaznamenán v dráze číslo 1, 3, 5 a 6 (odrůda Atribut, Krona, Ditta a Heris) - obrázek 1.

Obrázek 1: Elektroforeogram RAPD produktů amplifikovaných primerem H1 na modelovém souboru ječmene jarního (Hordeum vulgare L.), (šipkou je označena polymorfní zóna 780bp, S - Lambda DNA/Eco471(AvaII))

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

RAPD primer označený H2 (5´-GTA CGA CCT GA-3´) umožnil amplifikaci specifického produktu o velikosti 470 bp a 480 bp. Na obrázku 2 je tento marker přítomen pouze u odrůdy Ditta a Heris jako slabě intenzivní zóna (dráha číslo 5 a 6). Tento marker přítomnosti mlo11 potvrzuje shodu výskytu markeru této alely u těchto dvou odrůd jako v předchozí RAPD reakci.

Obrázek 2: Elektroforeogram RAPD produktů amplifikovaných primerem H2 na modelovém souboru ječmene jarního (Hordeum vulgare L.), (šipkou je označena polymorfní zóna 470-480bp, S - Lambda DNA/Eco471(AvaII))

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Použitý oligonukleotid H3 (5´-AAT GCG GGA G-3´) amplifikuje specifickou sekvenci DNA o velikosti 2 000 bp, jež je ve vazbě se zmíněnou alelou mlo11. Přítomnost tohoto markeru - polymorfní zóny - byla zaznamenána u odrůd Ditta, Heris a Nordus (dráha číslo 5, 6 a 7) - obrázek 3.

Obrázek 3: Elektroforeogram RAPD produktů amplifikovaných primerem H3 na modelovém souboru ječmene jarního (Hordeum vulgare L.), (šipkou je označena polymorfní zóna 2000bp, S - Lambda DNA/Eco471(AvaII))

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S

Diskuse

Modifikovaná metodika izolace DNA poskytovala templátovou DNA v potřebném množství a kvalitě vhodné pro následné RAPD analýzy. Každý z testovaných primerů (H1, H2, H3) RAPD reakce umožnil amplifikaci specifické zóny o velikosti 780bp, resp. 470 a 480bp, resp. 2000bp, které identifikovaly přítomnost alely mlo11. Tuto velikost RAPD markeru uvádí také Manninen et al. (1997). Použitá DNA analýza odrůd ječmene jarního (Hordeum vulgare L.) potvrdila přítomnost sledovaných RAPD markerů pouze u odrůd Ditta a Heris, a proto lze u těchto odrůd předpokládat výskyt rezistentní alely mlo11.

Závěr (praktické doporučení)

Z výsledků experimentální práce plyne, že po optimalizaci RAPD reakce je tato metoda vhodná pro markerování genů kvalitativních a kvantitativních znaků. Zvláště výhodné se využití této metody jeví ve šlechtitelském procesu, kde přítomnost či absence markeru na selektovaný znak lze odhalit již v juvenilní fázi vývoje rostlin.

Použitá literatura

ČERNÝ, J. - ŠAŠEK, A. - LANGER, I. - BRADOVÁ, J. - PAŘÍZEK, P. - VEJL, P. - VOPRŠAL, J.: Markering of some barley traits by means of hordein signal genes. Scientia Agriculturae Bohemica, 30 , 1999, 185 - 207.

DREISEITL, A.: Analýza populace padlí travního (Erysiphe graminis f. sp. hordei). Genetika a šlechtění, 27, 1991, 39 - 46.

JAHOOR, A. - FISHBECK, G.: Genetical studies of resistance of powdery mildew in barley lines derived from Hordeum spontaneum collected from Israel. Plant Breeding, 99, 1987, 265 - 273.

LAW, C.N.: Genetic manipulation in plant breeding - prospects and limitations. Euphytica, 85, 1995, 1 - 12.

MANNINEN, O. M. - TURPEINEN, T. - NISSILÄ, E.: Identification of RAPD markers closely linked to the mlo-locus in barley. Plant Breeding, 116, 1997, 461 - 464.

POMORCEV, A. A. - NECVETAJEV, V. P. et al.: Identifikacija šestogo lokusa, kontrolirujuščego sintez gordeina u ozimogo ječmeňa. Dokl. VASCHNIL, 1, 1983, 7 - 9.

Ostatní citovaná literatura je k dispozici u autora článku.